液相分离氨基酸方法（氨基酸的分离纯化方法）

如何用液相色谱仪测氨基酸

反相高效液相色谱法测定烟叶中的游离氨基酸

氨基酸是烟草中的一类重要化学物质，在烟草调制、醇化或发酵、加工直至燃烧过程中，游离氨基酸与还原糖之间可发生酶催化及非酶催化的棕色化反应，生成多种具有蒸煮、烤香、爆米花香味特征的吡喃、吡嗪、吡咯、吡啶类等杂环化合物，某些氨基酸如苯丙氨酸还可自身分解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇等。氨基酸含量与烟草制品的吃味有着密切的关系，氨基酸在燃烧裂解过程中一般形成具有刺激性的含氮化合物，对烟气香吃味产生不良影响，个别氨基酸还产生HCN等危害健康的烟气成分。一般说来，氨基酸含量太高，烟气辛辣、味苦、刺激性强烈；含量太低时烟气则平淡无味缺少丰满度。因此对氨基酸的分析是一项很有意义的工作，二十世纪60年代以来，国内外在这方面做了大量的工作[1-5]。

植物游离氨基酸样品的制备，国内外采用的提取剂和纯化方法各不相同。据文献报道[6-7]，盐酸、不同浓度的乙醇溶液均可以用来提取植物组织中的游离氨基酸；提取液纯化则有用阳离子交换树脂、5%磺基水杨酸、活性炭或乙醚等方法。本实验对不同的提取方式和不同的纯化方法进行了对比研究，确定提取烟叶中游离氨基酸的较佳提取剂和纯化方法。提取、纯化后的样品，采用OPA、FMOC联合柱前衍生反相高效液相色谱法对烟叶中的游离氨基酸进行了测定。该方法使带氨基和亚氨基基团的氨基酸能够被同时测定，且得到较好的定性定量结果。

1 实验

1.1 仪器

Agilent公司HP1100型高效液相色谱仪(带可变波长紫外检测器和自动进样器)，PE公司Lambda Bio40 紫外-可见分光光度计。

1.2 试剂

正缬氨酸（Norvaline，内标），OPA ，FMOC，均为色谱纯，Agilent公司提供；硼酸缓冲溶液，Agilent公司提供；

醋酸钠(NaAc)，分析纯，中国医药（集团）上海化学试剂公司；三乙胺（TEA），四氢呋喃（THF），乙腈（CH3CN），甲醇(MeOH)，均为色谱纯，Fisher公司试剂；

氨基酸标样包括：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、丝氨酸（Ser）、组氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、胱氨酸（Cys）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro），均为生化试剂，中国医药（集团）上海化学试剂公司；

苯乙烯阳离子交换树脂（732型），天津树脂厂。

1.3 样品处理

将烟叶在烘箱中恒温40℃烘干至恒重，粉碎，过80目筛，筛下物为实验用烟样粉末，置于广口瓶中备用。准确称取烟样粉末1.000g于干燥的洁净试管中，用一定浓度的乙醇溶液室温超声波提取半小时，过滤，相同浓度的乙醇溶液洗涤，再提取一次，合并后的滤液用阳离子交换柱洗脱，然后用95ml 4mol/L氨水淋洗阳离子交换柱，淋洗液恒温浓缩至干，最后用3ml 0.1mol/L稀盐酸溶液溶解浓缩物，将此溶液离心分离20min，0.45μm微孔滤膜过滤，加入浓度为5nmol/μ1的内标10μ1，定容至50ml，HP1100液相色谱仪进行氨基酸分析。

样品自动柱前衍生化：Agilent公司G1313A自动进样器进样。程序为：吸取5μl硼酸缓冲液，再吸取1μ1 OPA试剂，洗针一次，吸取样品2μl，原位混合6次。吸取1μl FMOC试剂，洗针一次，原位混合3次，进样。

1.4 色谱条件

色谱柱：Hypersil AA-ODS C18 2.1×200mm

流动相A：1.36±0.025g醋酸钠，加入500ml纯水溶解，加90μl三乙胺，用1%醋酸调pH=7.20±0.05，再加入1.5ml四氢呋喃，混合均匀。

流动相B：1.36±0.025g醋酸钠，加入100ml纯水溶解，用1%醋酸调pH=7.20±0.05，将此溶液加至200ml乙腈和200ml甲醇的混合物中，并混合均匀。

流速：0.45ml/min

柱温：40℃

紫外检测波长: 0～16min， 338nm； 16～25min，262nm

淋洗梯度：见表1

表1 流动相的淋洗梯度表

Table 1 The gradient time table of mobile phase

序列 时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%） 流速（ml/min）

1 0.00 100.0 0.0 0.450

2 15.50 40.0 60.0 0.450

3 18.00 0.0 100.0 0.450

4 21.00 0.0 100.0 0.800

5 23.90 0.0 100.0 0.800

6 24.00 0.0 100.0 0.450

7 25.00 100.0 0.0 0.450

1.5 氮基酸的定性

用标样色谱图、文献参照和标样加入的方法，通过对照保留时间进行定性，对氨基酸的出峰顺序加以确认。

1.6 内标法定量

准确移取浓度为10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合标样100μl于带内衬管的样品瓶中，再加入250pmol/μ1内标溶液100μl，充分混合，液相色谱分析，仪器自动计算各氨基酸的标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 萃取溶剂的比较

氨基酸可溶解于水、乙醇、甲醇、稀酸等，因此它们均可作为烟叶中游离氨基酸的萃取溶剂，传统的方法是用乙醇和0.1mol/L的盐酸。实验发现，乙醇和0.1mol/L的盐酸萃取方法比较，提取出的烟叶中的游离氨基酸的总量变化不大，但用盐酸提取的样品分析时RSD%较大，平均8.51%，其中超过10%的有4个，甘氨酸的RSD%最大为20%；而用乙醇提取的样品分析时RSD%相对较小，平均5.12%，超过10%的只有1个。而且盐酸提取液过滤速度慢，需要30-40min，而乙醇提取液过滤只需10min左右；因此，本实验选择乙醇作为烟叶中游离氨基酸的萃取溶剂。

2.2 乙醇浓度的选择

选择五种不同浓度的乙醇溶液进行了烟样中游离氨基酸的提取，测定不同条件下提取液中游离氨基酸的总量，结果如图1。图中显示，在乙醇溶液浓度为80%时，烟样中总游离氨基酸的提取量最大。而且不同浓度下游离氨基酸的RSD%没有明显的变化，因此，选择80%的乙醇溶液来进行烟样中游离氨基酸的提取。

2.3 不同纯化方法的确定

在最佳乙醇溶液浓度下，分别用活性炭加入提取液吸附杂质、乙醚加入提取液萃取分离杂质、5%磺基水杨酸加入提取液沉淀去除杂质和阳离子交换树脂吸附杂质四种方法进行了纯化实验。结果发现，活性炭作为纯化剂时其色谱图中杂质峰较少，但同时氨基酸峰亦有多个消失，主要是因为活性炭对氨基酸也有较强的吸附，它在吸附杂质的同时也吸附了需要检测的氨基酸，故活性炭不适合作为纯化剂使用。乙醚和5%磺基水杨酸作为纯化剂时，杂质去除不完全，其色谱图均表现为杂质峰较多，湮没了大量氨基酸峰，且基线漂移严重，给定性定量工作带来困难。当用阳离子交换树脂进行纯化时，其色谱图中杂质峰较少，基线平稳，氨基酸峰分离较好，均可以进行定性和定量分析，故本实验选择了阳离子交换树脂作为纯化手段。

2.4 色谱分离

2.5 线性范围及标准曲线

分别取浓度为10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合标样加入等体积的250 pmol/μ1的内标溶液，进行HPLC分析，以氨基酸浓度为横坐标，氨基酸与内标的面积比为纵坐标，得到各个氨基酸的标准曲线，如表2所示。从表中可以看出，各氨基酸在10-1000 pmol/μ1的浓度范围内均有良好的线性，各氨基酸标准曲线的线性相关系数均大于0.99。

表2 氨基酸的标准曲线

Table 2 Standard curves of 17 amino acids

氨基酸 线性方程 相关系数

Asp Y=0.007037x+0.004689 0.9972

Glu Y=0.007520x+0.005375 0.9961

Ser Y=0.006903x+0.038212 0.9988

His Y=0.003719x+0.020168 0.9945

Gly Y=0.005851x+0.018235 0.9966

Thr Y=0.006932x+0.021072 0.9978

Ala Y=0.006275x+0.015314 0.9912

Arg Y=0.006088x+0.016113 0.9920

Tyr Y=0.006734x+0.015022 0.9993

Cys Y=0.006004x+0.009876 0.9985

Val Y=0.006432x+0.009932 0.9927

Met Y=0.006574x+0.010346 0.9905

Phe Y=0.005098x+0.019023 0.9962

Ile Y=0.005976x+0.016235 0.9953

Leu Y=0.006044x+0.015332 0.9964

Lys Y=0.006833x+0.010437 0.9969

Pro Y=0.022455x+0.009376 0.9922

2.6 重现性实验

取云南C2F99烟样做平行实验（n=5），进行烟叶中游离氨基酸含量的检测，结果发现： Asp和 Glu含量的RSD%分别为8.0%和8.6%，这可能是二者的分离度不高引起的；His的RSD%为9.0%，这可能与其含量较低，分离效果不好有关。其它氨基酸含量的RSD%均处在3%～7%。

2.7 回收率实验

用标样加入法进行回收率实验，结果见表3。 Thr的回收率仅为68.0%，原因可能与其含量较少有关；其它15种氨基酸的回收率在81.0%～110.5%，平均回收率为93.9%，说明该方法的回收率结果令人满意。

表3 分析方法的回收率

Table 3 Recovery percents of the analytical method

氨基酸 加入量（mg/g烟样） 样品含量（mg/g烟样） 测定值（mg/g烟样） 差值（mg/g烟样） 回收率%

Asp 0.200 0.320 0.499 0.179 89.5

Glu 0.200 0.309 0.484 0.175 87.5

Asn 0.200 0.986 1.208 0.222 110.0

Ser 0.200 0.172 0.334 0.162 81.0

Gln 0.200 0.186 0.368 0.182 91.0

His 0.200 0.106 0.297 0.191 95.5

Gly 0.200 0.064 0.279 0.215 107.5

Thr 0.200 0.052 0.188 0.136 68.0

Ala 0.200 0.642 0.835 0.193 96.5

Arg 0.200 0.266 0.463 0.197 98.5

Val 0.200 0.090 0.259 0.169 84.5

Phe 0.200 0.218 0.406 0.188 94.0

Ile 0.200 0.026 0.191 0.165 82.5

Leu 0.200 0.028 0.199 0.171 85.5

Pro 0.200 1.432 1.653 0.221 110.5

Tyr 0.200 0.062 0.245 0.183 91.5

2.8 样品分析

利用该方法对不同等级的烟叶中游离氨基酸的含量进行了分析，结果见表4。从表中可以看出，在所分析的样品中，烤烟烟叶中含量最高的氨基酸是Pro，白肋烟烟叶中含量最高的氨基酸是Asp和Asn；白肋烟烟叶中氨基酸的含量高于烤烟烟叶；相同等级的烤烟烟叶，云南烟叶中的氨基酸含量高于其它产区。

表4 不同等级烟叶中游离氨基酸的含量（mg/g烟样）

Table 4 Amounts of free amino acids in different

grade tobacco leaves（mg/g tobacco leaves）

氨基酸 云南烤烟C1F 云南烤烟C2F 云南烤烟C1L 云南烤烟B1F 云南烤烟B2F 福建烤烟B1F 福建烤烟C1F 四川烤烟C1F 四川烤烟B1F 贵州烤烟C1F 贵州烤烟B1F 贵州烤烟C1L 鄂西白肋中一 鄂西白肋中二

Asp 0.24 0.31 0.60 0.40 0.38 0.37 0.26 0.37 0.26 0.26 0.32 0.35 1.73 1.59

Glu 0.36 0.32 0.21 0.17 0.16 0.11 0.15 0.20 0.30 0.32 0.29 0.25 0.54 0.61

Asn 0.91 0.34 1.50 0.95 0.38 0.18 0.25 0.35 0.32 0.44 0.55 0.48 7.70 7.62

Ser 0.16 0.10 0.18 0.16 0.10 0.12 0.24 0.21 0.19 0.20 0.19 0.15 0.62 0.58

Gln 0.19 0.05 0.22 0.17 0.04 0.06 0.10 0.11 0.10 0.11 0.15 0.10 0.18 0.20

His 0.11 0.02 0.14 0.10 0.06 0.06 0.11 0.09 0.07 0.09 0.08 0.09 0.20 0.22

Gly 0.10 0.09 0.19 0.17 0.07 0.08 0.12 0.15 0.12 0.15 0.13 0.12 0.16 0.19

Thr 0.05 0.05 0.08 0.06 0.05 0.04 0.08 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.19 0.16

Ala 0.65 0.55 0.84 0.69 0.54 0.51 0.65 0.59 0.55 0.48 0.53 0.70 0.57 0.55

Arg 0.29 0.21 0.32 0.28 0.18 0.26 0.32 0.28 0.25 0.33 0.29 0.33 0.48 0.42

Tyr 0.06 0.07 0.06 0.07 0.06 0.05 0.07 0.05 0.06 0.06 0.07 0.06 0.10 0.15

Val 0.10 0.10 0.12 0.11 0.10 0.14 0.15 0.13 0.12 0.15 0.14 0.13 0.21 0.25

Met 0.07 0.07 0.09 0.08 0.06 0.06 0.08 0.08 0.08 0.07 0.09 0.08 0.12 0.13

Phe 0.26 0.12 0.28 0.23 0.10 0.21 0.25 0.21 0.25 0.28 0.30 0.33 0.44 0.59

Pro 1.14 0.83 2.13 1.51 0.69 0.66 1.03 1.23 1.11 1.32 1.18 1.09 0.25 0.35

总量 4.69 3.23 6.96 5.15 2.97 2.91 3.86 4.14 3.86 4.33 4.37 4.31 13.49 13.61

3 结论

本烟叶中游离氨基酸的分析方法采用80%的乙醇作为萃取溶剂，阳离子交换树脂对提取液进行纯化，能够最大程度地提取烟叶中的游离氨基酸并较好地去除了影响氨基酸测定的杂质，使色谱图中杂质峰较少；OPA、FMOC联和柱前衍生使带氨基和亚氨基基团的氨基酸同时得到测定；良好的梯度洗脱使各个氨基酸峰得到较好的分离，并使定量结果更加可靠。

18种氨基酸用液相色谱该怎么检测

建立一种准确、快速柱前衍生高效液相色谱法测定脑卒中患者血清 中18种游离氨基酸的方法,为临床治疗脑卒中提供依据.方法：利用高效液相色谱二极管阵列检测法对AQC衍生的氨基酸产物进行分离.采用thermo C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,PH 5.09的乙酸铵溶液和60％的乙腈水溶液为流动相,检测波长248nm,利用梯度洗脱的方式测定血清中1 8种氨基酸.结果：谷氨酰胺在0.0125-2mmol/L浓度范围内,胱氨酸在0.00625-0.25mmol/L浓度范围内,其余16种氨基酸在 0.0 125-0.5mmol/L浓度范围内线性关系良好.R2为0.9907-0.9999,RSD为1-4％.结论：利用此方法可以检测缺血性脑卒中患者血 清中游离氨基酸,测定结果准确可靠,方法简单易行.

液相色谱怎么实现十八种氨基酸的分离

如果是两个氨基酸的保留时间距离太近，那么只能调整液相条件了。比如调整流动相比例，或者是梯度比例，把两个氨基酸拉开。

也可以适当调整衍生程序。虽然衍生程序不会对氨基酸的保留时间有影响，不过会对它的信号产生影响。如果这两种氨基酸的峰高有所下降，或许分离度也可以达到要求。

还有就是注意峰型。衍生化程序很容易损坏色谱柱，超高效色谱的压力又高，色谱柱很容易损毁。如果峰型不好，建议用纯乙腈低流速反冲色谱柱。或者是更换新色谱柱。

怎么用液相分离氨基酸啊，不用衍生化方法的，求大神

如果是两个氨基酸的保留时间距离太近，那么只能调整液相条件了。比如调整流动相比例，或者是梯度比例，把两个氨基酸拉开。

也可以适当调整衍生程序。虽然衍生程序不会对氨基酸的保留时间有影响，不过会对它的信号产生影响。如果这两种氨基酸的峰高有所下降，或许分离度也可以达到要求。

还有就是注意峰型。衍生化程序很容易损坏色谱柱，超高效色谱的压力又高，色谱柱很容易损毁。如果峰型不好，建议用纯乙腈低流速反冲色谱柱。或者是更换新色谱柱。

氨基酸的分离

一、沉淀法：1.利用氨基酸的溶解度分离或等电点沉淀

2.特殊试剂沉淀法

二、离子交换：离子交换是利用不溶性高分子化合物,就是离子交换树脂对不同氨基酸吸附能力的差异对氨基酸混合物进行分组或实现单一成分的分离.

三、萃取：1、反应萃取：选取适当的反应萃取剂,其解离出来的离子与氨基酸解离出来的离子发生反应,生成可以溶于有机溶剂的萃取配合物,从而使氨基酸从水相进入有机相.

2、反相微胶团萃取：反相微胶团是溶在有机溶剂中的表面活性剂自发形成的纳米级的聚体,表面活性剂的极性尾与外在非极性的有机溶剂接触,而极性头则排列在内形成极性核,极性核溶于水后就形成了“水池”,当含有氨基酸的水溶液与反相微胶团的有机溶剂相混合时,氨基酸以带电离子状态进入反相微胶团的水池内而被分离

氨基酸分离的方法还有很多,但是常用的就是离子交换.

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