氨基酸的分离实验总结（了解氨基酸的分离与测定方法）

纸层析法分析氨基酸结果

氨基酸的分离鉴定——纸层析法

一,实验目的

掌握氨基酸纸层析的方法和原理,学会分析待

测样品的氨基酸成分.

二,实验原理

纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析.滤纸纤维上的羟基具有亲水性,吸附一层水作为固定相,有机溶剂为流动相.当有机相流经固定相时,物质在两相间不断分配而得到分离.

溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示:

Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

在一定的条件下某种物质的Rf值是常数.Rf值的大小与物质的结构,性质,溶剂系统,层析滤纸的质量和层析温度等因素有关.本实验利用纸层析法分离氨基酸.

三,实验器材

(1)大烧杯(5000mL):1只/组

(2)微量注射器(100

L):1只/

组.

(3)喷雾器:公用.

(4)培养皿:1只/组.

(5)层析滤纸(长22cm,宽14cm的新华一号滤纸):1张/组.

(6)直尺,铅笔:自备.

(7)电吹风:1只/组.

(8)托盘,针,白线:1套/组.

(9)手套:1双/组.

(10)塑料薄膜:公用.

(11)小烧杯:50mL,1只/组.

四,实验试剂

(1)扩展剂:将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中,与5体积水混合,充分振荡,静置后分层,弃去下层水层.

(2)氨基酸溶液:0.5%的已知氨基酸溶液3种(赖氨酸,苯丙氨酸,缬氨酸),0.5%的待测氨基酸液1种.

(3)显色剂:0.1%水合茚三酮正丁醇溶液.

实验试剂

五,实验操作

检查培养皿是否干燥,洁净;若否,将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干.

(1)平衡:剪一大块塑料薄膜铺在桌面上,将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上,再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中,用塑料薄膜密封起来,平衡20min.

(2)规划:带上手套,取宽约14cm,高约22cm的层析滤纸一张.在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A,在直线上做4个记号,记号之间间隔2cm,这就是原点的位置.另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B,在B线上以A,B两线的交点为原点标明刻度(以厘米为单位),参见左图.

(3)点样:用微量注射器分别取10mL左右的氨基酸样品(每取一个样之前都要用蒸馏水洗涤微量注射器,以免交叉污染),点在这四个位置上.挤一滴点一次,同一位置上需点2～3次,2～3mL/次,每点完一点,立刻用电吹风热风吹干后再点,以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm.每人须点4个样,其中3个是已知样,1个是待测样品.

(4)层析:用针,线将滤纸缝成筒状,纸的两侧

边缘不能接触且要保持平行,参见图3-3.向培养皿中加入扩展剂,使其液面高度达到1cm左右,将点好样的滤纸筒直立于培养皿中(点样的一端在下,扩展剂的液面在A线下约1cm),罩上大烧杯,仍用塑料薄膜密封.当扩展剂上升到A线时开始计时,每隔一定时间测定一下扩展剂上升的高度,填入表3-1中.当上升到15～18cm,取出滤纸,剪断连线,立即用铅笔描出溶剂前沿线,迅速用电吹风热风吹干.

(5)显色:用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液,然后立即用热风吹干,即可显出各层析斑点,参见左图.

(6)计算各种氨基酸的Rf值,并判断混合样品中都有哪些氨基酸,各人将自己的实验结果贴在实验报告上,见表3-2.

(7)以层析时间为横坐标,扩展剂上升高度为纵坐标画图,求出扩展剂上升到18cm时所需要的时间.

(8)将微量注射器内外用蒸馏水清洗干净,倒掉用过的展层液和平衡液,将培养皿洗净,整理好桌面上的仪器和试剂.

氨基酸的分离实验总结（了解氨基酸的分离与测定方法）

有机化学中氨基酸的分离和鉴定的思路是什么呀?

1.基础知识（若学过氨基酸的酸碱性，可直接pass）

氨基酸分子中的氨基是碱性的，而羧基则是酸性的。但它们的酸碱解离常数比一般的羧基-COOH和氨基-NH2低。

例如：甘氨酸：Ka=1.6×10-10，Kb=2.5×10-12

大多数的羧酸：Ka=10-5

这说明氨基酸在一般情况下不是以游离态的羧基和氨基存在的，而是以内盐的形式存在（内盐：偶极离子），H3N+ _CHRCOO – 。

可以把测得氨基酸的Ka值看成是氨基酸中铵离子的酸度：Ka~NH3+

把测得氨基酸的Kb值看成是氨基酸中羧酸根离子的碱度：Kb~COO-

氨基酸即带有氨基，又带有羧基，所以是两性化合物，既能和酸反应，也能和碱反应。在强酸性溶液中，以正离子形式存在，在强碱性溶液中以负离子形式存在。

若能水解的氨基个数少于能水解的羧基个数(溶液呈酸性)，则为酸性氨基酸，包括：天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺四种；若能水解的氨基个数多于能水解的羧基个数(溶液呈碱性)，则为碱性氨基酸，包括：赖氨酸，精氨酸，组氨酸，脯氨酸四种。

2.氨基酸的电泳

当氨基酸的溶液置于电场中时，所发生的变化取决于溶液的酸碱度。

在相当碱性的溶液中，阴离子Ⅱ超过阳离子Ⅲ，因此氨基酸向阳极迁移；在相当酸性的溶液中，阳离子Ⅲ是过量的，因此，氨基酸向阴极迁移，如果Ⅱ和Ⅲ完全相等，那么，没有净迁移。在这样的条件下，任何一个分子作为正离子和作为负离子存在的机会是完全相等的，向一个电极方向的任何微小移动，马上就被一个相等的朝另一个电极的方向移动所抵消。当一个特定的氨基酸在电场的影响下不发生迁移时，这个氨基酸所在溶液的氢离子浓度叫做氨基酸的等电点,通常pI表示。净电荷为零的氨基酸所在的溶液的pH值为pI。

氨基酸的pI值主要由其羧酸和氨基的电离常数来决定的，假如以pK1代表-COOH 基的电离常数，pK2代表-NH3+基团电离常数，则pI和它们的关系可用下式表示：见图片

在等电点时，氨基酸的溶解度最小，因而用调节等电点的方法可以从氨基酸的混合物中分离出某些氨基酸。

中性氨基酸pI =5.5~6.3 ，酸性氨基酸pI =2.8~3.2 ，碱性氨基酸pI =7.6~10.6。一般来说，氨基酸含氨基，pI值较高，含羧基多者pH值较低。当氨基酸中氨基多于一个时，当净电荷为零时，氨基酸溶液碱性强于氨基与羧基相等的溶液的pH值，故溶液pH值较高，pI值高。同理，氨基酸羧基多时，pI值较值小。

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这一部分是比较难理解，不清楚的地方还可以再问我。

向左转|向右转

层析法分离氨基酸的原理是？详细说明，谢谢

二、原理

纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分

配层析法，其中滤纸纤维上吸附的水是固定相

水是固定相，

配层析法，其中滤纸纤维上吸附的水是固定相，

展层用的有机溶剂是流动相

在层析时，

有机溶剂是流动相。

展层用的有机溶剂是流动相。在层析时，

将样品点在距滤纸一端约2～

的某一处，

将样品点在距滤纸一端约

～3cm的某一处，

的某一处

该点称为原点；

该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂

沿滤纸的一个方向进行展层，

沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基

酸在两相中不断分配。由于分配系数（

酸在两相中不断分配。由于分配系数（Kd）

不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。

物质被分离后在纸层析图谱上的位置，

物质被分离后在纸层析图谱上的位置，可用

比移值（

来表示。

比移值（Rf）来表示。

所谓R

是指在纸层析中，

所谓

f，是指在纸层析中，从原点至氨基酸

停留点（又称为层析点）中心的距离（

）

停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与

原点至溶剂前沿的距离（

）的比值。

原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值。如图

原点到层析点中心的距离

原点到溶剂前沿的距离

在一定条件下（如温度、展层剂的组成、

层析纸质量等不变），某种物质的R

），某种物质的

层析纸质量等不变），某种物质的

值是常

因此可作为定性依据。

数，因此可作为定性依据。

由于氨基酸无色，

由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使

氨基酸层析斑点显色，从而作定性分析。

氨基酸层析斑点显色，从而作定性分析。本

实验利用纸层析法分离氨基酸。