如何做磷酸化氨基酸位点的突变
根据以前所看的文献,磷酸化位点通常是丝氨酸和苏氨酸,可以将这些氨基酸利用定点诱变的方式突变为丙氨酸或谷(天冬)氨酸,从而将原有的磷酸化位点失活或持续保持活性(模拟组成型磷酸化),respectively.
另外需要注意的是,你所研究的目标蛋白往往具有多个磷酸化位点,而其中只有特定的一个或几个磷酸化位点参与你所要研究的活性,
利用重组PCR，把Ser Thr突变为Ala，表达，然后测序即可，剩下的就是常规的实验了
什么是定点突变
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。
酶的化学修饰在理论研究和实际生产中有哪些应用？
1、定点突变
目前，科研人员已开始通过一些可控制的方法在酶或蛋白质特殊的位点引入特定分子进行修饰，并结合定点突变引入一种非天然氨基酸侧链来进行化学修饰，从而得到一些新颖的酶制剂。这一策略是利用定点突变技术在酶的关键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰法对突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化合物，得到一种化学修饰突变酶（Chemically modified mutant enzymeCMM）。已利用定点突变法在枯草杆菌蛋白酶SBL的特定位点中引入半胱氨酸，然后用甲基磺酰硫醇试剂进行硫代烷基化，得到一系列新型的化学修饰突变枯草杆菌蛋白酶。酶的kcat/KM值随疏水基团R的增大而增大，而且绝大部分CMM的kcat/KM值都大于天然酶，有些甚至增加了2.2倍，因此CMM能够改进酶的专一性及扩大催化底物范围。
2、交联技术
使用双功能基团试剂如戊二醛、PEG等将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部分，进行共价交联，可使分子活性结构加固，并可提高其稳定性，扩大了酶在非水溶剂中的使用范围。已使用戊二醛进行酶交联的研究，证实了利用交联酶晶体（crosslinkedenzyme cry stal，CLEC）技术提高了嗜热菌蛋白酶的生物活性，增加了其热稳定性。枯草杆菌蛋白酶经预处理，冻干形成交联酶晶体，在有机溶剂和水溶液中的稳定性大大增加，活力可提高13倍。交联酶晶体制备分为两步：①酶晶体的形成；②保持酶活性，保持酶晶体的晶格不被破坏，进行化学交联。多功能交联试剂除了传统的戊二醛外，还包括一些新近开发成功的化合物，例如，糖基化作用与交联技术联合应用于青霉素G酰化酶，利用葡聚糖二乙醛将青霉素G酰化酶进行交联，使其在55℃下的半衰期提高9倍。酶的稳定性提高的主要原因是交联增强了葡聚糖的羟基与酶分子亲水基团间的相互作用。
3、小分子化合物
利用小分子化合物对酶活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰，可以改变酶学性质。已被广泛应用的小分子化合物主要有邻苯二酸酐、氨基葡萄糖、醋酸酐、硬脂酸等。D-葡糖胺与未糖基化的RNase A进行化学偶联，得到单糖基化酶和双糖基化酶，其中，53位的天冬氨酸和49位的谷氨酸被认为可能是糖基化位点，经过修饰的单糖基化RNase A活力比天然酶低，但是热稳定性大大提高。氧化还原酶中的谷胱甘肽过氧化物酶是不稳定的，但人们对它很感兴趣。通过使用化学修饰的方法，用不稳定的氧化型硒原子取代胰蛋白酶中195位丝氨酸γ位的氯原子，使之转变为硒基胰蛋白酶，硒基胰蛋白酶失去了还原酶的活性，而表现出较强的谷胱甘肽氧化酶的活性。
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