rbd氨基酸（RGD氨基酸序列）

本文目录一览：

• 1、DNA与蛋白质相互作用的研究方法有哪些
• 2、braf基因检测15号外显子突变v600e是什么意思?
• 3、新冠病毒变异未明显影响中国疫苗有效性，这能说明什么？
• 4、奥密克戎BA.2.12.1变异株进入广东，该变异株有什么特点？
• 5、英国发现的新冠病毒变种再次发生突变意味着什么？

DNA与蛋白质相互作用的研究方法有哪些

在许多的细胞生命活动中，例如DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用的问题。重组DNA技术的发展，人们已分离到了许多重要的基因。现在的关键问题是需要揭示环境因子及发育信号究竟是如何控制基因的转录活性。为此需要：a、鉴定分析参与基因表达调控的DNA元件；b、分离并鉴定这些顺式元件特异性结合的蛋白质因子；这些问题的研究都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用。

研究DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括：a、凝胶阻滞实验； b、DNase 1 足迹实验；c、甲基化干扰实验； d、体内足迹实验； f、拉下实验。研究蛋白质/ 核酸相互作用近期采用的新技术有：核酸适体技术、生物信息学方法、蛋白质芯片技术以及纳米技术等。

凝胶阻滞实验

1、概念：

凝胶阻滞实验（Gel retardation assay），要叫做DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay）或条带阻滞实验（Band retardation assay）是在八十年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。

2、原理：

在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反比。如果某种DNA分子结合上一种特殊的蛋白质，那么由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，于是朝正极移动的距离也就相应的缩短，因而在凝胶中出现滞后的条带，这就是凝胶阻滞实验的基本原理。

3、过程:

首先制备细胞蛋白质提取物（理论上其中含有某种特殊的转录因子）

用放射性同位素标记待检测的DNA片段（含有转录因子的结合位点）

这种被标记的探针DNA同细胞蛋白质提取物一起进行温育，于是产生DNA-蛋白质复合物

在控制使DNA-蛋白质保持结合状态的条件下，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

最后进行放射自显影，分析电泳结果

4、实验结果的分析：

a、如果有放射性标记的条带都集中于凝胶的底部，这就表明在细胞提取物中不存在可以同探针DNA相互结合的转录因子蛋白质；

b、如果在凝胶的顶部出现放射性标记的条带，这就表明细胞提取物存在可与探针DNA结合的转录因子蛋白质。

5、DNA竞争实验：

DNA竞争实验（DNA competitive assay）的具体做法如下：

在DNA-蛋白质结合的反应体系中加入了超量的非标记的竞争DNA（competitor DNA），如果它同探针DNA结合的是同一种转录因子蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，这样绝大部分转录因子蛋白质都会被竞争结合掉，而使探针DNA仍然处于自由的非结合状态，可以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带；

如果反应体系中加入的竞争DNA并不能同探针DNA竞争结合同一种转录因子，结果在电泳凝胶中的放射自显影图片上就会出现阻滞的条带。

6、应用：

a、凝胶阻滞实验可以用于鉴定在特殊类型细胞蛋白质提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有转录因子结合位点）结合的转录因子蛋白质；

b、DNA竞争实验可以用来检测转录因子蛋白质同DNA结合的精确序列部位；

c、通过竞争DNA中转录因子结合位点的碱基突变可以研究此种突变竞争性能及其转录因子结合作用的影响；

d、也可以利用DNA同特定转录因子的结合作用通过亲和层析来分离特定的转录因子。

DNaseI足迹实验

1、定义:

足迹实验（foot-printing assay），是一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构的专门实验方法。

2、原理：

当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI 酶的切割作用，而不会产生出相应的切割分子，结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区，俗称为“足迹”。

3过程：

将待检测的双链DNA分子在体外用32P作5‘末端标记，并用适当的限制性内切酶切出其中的一个末端，于是便得到了一条单链末端标记的双链DNA

在体外同细胞蛋白质提取物（细胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白质复合体

在反应混合物中加入少量的DNase I,并控制用量使之达到平均每条DNA链，只发生一次磷酸二酯键的断裂：

a、如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特定蛋白质，使DNase I消化之后，便会产生出距离放射性标记末端1个核苷酸，2个核苷酸，3个核苷酸——等等一系列前后长度均相差一个核苷酸的不间断的连续的DNA片段梯度群体；

b、如果DNA分子同蛋白质提取物中的某种转录因子结合，被结合部位的DNA就可以得到保护免受DNase I酶的降解作用；

除去蛋白，加样在20%序列胶上进行电泳分离，实验分两组:

a、实验组：DNA+蛋白质混合物

b、对照组：只有DNA，未与蛋白质提取物进行温育

最后进行放射性自显影，分析实验结果。

4、结果判断:

实验组凝胶电泳显示的序列，出现空白的区域表明是转录因子蛋白质结合部；与对照组序列比较，便可以得出蛋白质结合部位的DNA区段相应的核苷酸序列。

5、其他的足迹实验方法：

除了DNase1足迹试验之外，目前还发展出了若干种其他类型的足迹实验，例如：

a、 自由羟基足迹实验；b、菲咯啉铜足迹实验；c、DMS(硫酸二甲酯)足迹实验

DMS(硫酸二甲酯)足迹实验的原理

DMS能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割。如果DNA分子中某一区段同转录因子结合，就可以避免发生G残基的甲基化而免受六氢吡啶的切割作用。

甲基化干扰实验

1、概念：

甲基化干扰实验（Methylation interference assay）是根据DMS（硫酸二甲酯）能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割这一原理设计的另一种研究蛋白质同DNA相互作用的实验方法。

应用这种技术可以检测靶DNA中G残基的优先甲基化，对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细的揭示出DNA与蛋白质相互作用的模式。

2、实验步骤：

用DMS处理靶DNA使之局部甲基化（平均每条DNA只发生一个G碱基甲基化作用）

同细胞蛋白质提取物一起进行温育，促进使DNA与蛋白质的结合

进行凝胶电泳形成两种靶DNA条带：

a、 其一没有同蛋白质结合的DNA正常电泳条带

b、其二同特异蛋白质结合而呈现滞后的DNA电泳条带

将这两种DNA电泳条带分别从凝胶中切出，并用六氢吡啶进行切割，结果为：

a)、甲基化的G残基被切割:因为转录因子蛋白质只能够同未发生甲基化的正常的结合位点结合，所以在转录因子DNA结合位点序列中的G残基如果被DMS甲基化之后，转录因子就无法同其结合位点（顺式元件）发生结合作用，从而使得结合位点中的G残基同样也要被六氢吡啶切割；

b)、不具有甲基化G残基的靶DNA 序列则不会被切割

将结合蛋白质的DNA条带和不结合蛋白质的DNA条带，经六氢吡啶切割作用之后，再进行凝胶电泳

作放射自显影，读片并分析结果

3、结果判断：

a、同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列，经六氢吡啶切割之后，电泳分离呈现两条带，有一个空白区

b、不同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列，经六氢吡啶切割后，电泳分离呈现三条带，没有空白区域的出现。

4、应用：

a、甲基化干扰实验可以用来研究转录因子与DNA结合位点中的G残基之间的联系；

b、是足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹实验中DNA与蛋白质相互作用的精确位置

5、缺点：

DMS只能使DNA序列中的G和A残基甲基化，而不能使T和C残基甲基化。

体内足迹实验

上面讨论的三种研究转录因子与DNA相互作用的方法，有一个共同的不足之处在于它们是在体外进行的实验，因此人们就会考虑这些实验结果是否能够反映细胞内发生的真实生命过程，即细胞内发生的真实的DNA与蛋白质的相互作用情况。

为了解答这个问题，科学家就设计出了一种体内足迹试验（in vivo foot-printing assay），该方法可以看做是体外DMS足迹实验的一个变种。

1、原理：

体内足迹试验的原理原则上同体外DMS足迹实验无本质差别，即

a、DMS能够使G残基甲基化；

b、六氢吡啶能特异的切割甲基化的G残基；

c、同特异转录因子蛋白质结合的识别序列中的G残基由于受到蛋白质的保护而不会被DMS甲基化，于是不会被六氢吡啶切割；

d、同对照的裸露的DNA形成的序列梯作比较，就会发现活细胞DNA形成的序列梯中缺少G残基没有被切割的相应条带。

2、过程：

用有限数量的化学试剂DMS处理完整的游离细胞，使渗透到胞内的DMS浓度恰好导致天然染色体DNA的G残基发生甲基化

对这些经过DMS处理的细胞提取DNA，并在体外加入六氢吡啶作消化反应

PCR扩增后作凝胶电泳分析，因为在体外实验中用的是克隆的DNA片段其数量足够，而在体内足迹实验中用的是从染色体DNA中分离获得的任何一种特异的DNA，其数量是微不足道的，所以需要经PCR扩增以获得足够数量的特异DNA

放射自显影，读片并记录读片的结果

3、结果判断：

a、能够同转录因子蛋白质结合的DNA区段其中G残基受到保护因而不会被DMS甲基化避免了六氢吡啶的切割作用；

b、体外裸露的DNA分子上，G残基被DMS甲基化而被六氢吡啶切割。

拉下实验（Pull-down assay）

拉下实验又叫做蛋白质体外结合实验（binding assay in vitro），是一种在试管中检测蛋白质之间相互作用的方法。其基本原理是将某种小肽（例如生物素、6-His标签以及谷胱甘肽转移酶等）的编码基因与诱饵蛋白的编码基因重组，表达为融合蛋白。分离纯化融合蛋白并与磁珠结合，使之固相化之后，再与表达目的蛋白的细胞提取物混合保温适当时间，例如在4℃下保温过夜，使目标蛋白同已经固定在磁珠表面的融合蛋白中的诱饵蛋白充分的结合。离心收集与固定化的融合蛋白（即与磁珠相互结合的融合蛋白）中的诱饵蛋白相结合的目的蛋白，经过煮沸处理使目的蛋白与诱饵蛋白相脱离从而从固相支持物（例如磁珠）上脱离下来，收集样品，再与目标蛋白的抗体作Western blotting分析，以检测出与诱饵蛋白的目标的目标蛋白。

一些新的研究蛋白质/ 核酸相互作用的方法和技术，主要从核酸适体技术、生物信息学方法、蛋白质芯片技术以及纳米技术等方面进行综述。

核酸适体技术

核酸适体(aptamer)指的是经过一种新的体外筛选技术——指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸，可以是RNA 也可以是DNA，长度一般为25~60 个核苷酸。SELEX 的筛选流程首先是利用现有的分子生物学技术人工合成一个含有1014~1015 个单链寡核苷酸序列的随机文库，序列长度往往在25~35 个核苷酸之间，单链的随机寡核苷酸序列容易形成可与蛋白质等配体特异性共价结合的二级结构，在这一高亲和力特异性结合的基础之上配体蛋白质同随机文库相互作用，选择性分离出核酸适体后，然后通过PCR或RT-PCR 等技术进行扩增。次一级文库再与配体蛋白质相互作用，反复多次循环，即可获得与配体蛋白质特异性高亲和力结合的核酸适体。核酸适体与配体间的亲合力(解离常数在皮摩和纳摩之间)常要强于抗原抗体之间的亲合力[3]。核酸适体所结合的靶分子范围非常广泛，除蛋白质之外，还能作用于酶、生长因子、抗体、基因调节因子、细胞黏附分子、植物凝集素、完整的病毒颗粒、病原菌等[4]。适体从20 世纪90 年代初出现以后，就得到了科研工作者的广泛关注，适体的研究工作得到了快速的发展。SELEX 筛选技术和核酸适体的高亲和性在蛋白质/ 核酸相互作用的研究中发挥了重要的作用。Wen等[5]研究了同细菌噬菌体Ff 基因5蛋白(g5p) 高亲和力结合的核酸适体，发现G 富集基序对于形成g5p 连接启动子结构，提供实际的g5p 连接位点具有重要的意义。White 等[6]利用SELEX 技术研究了一种PUM2HD (短小杆菌素同源结构域)及其RNA 核酸适体，发现在PUM2 氨基端有Ser和Glu/Ala富集区，并且PEB ( PUM2 连接元件)与果蝇反应元件的3’端具有亲缘关系，但又互不相同。Bouvent等[7]利用NRE(核仁蛋白识别元件) 发现了RNA 茎环上的RBD1 和RBD2 (折叠元件结构域)，这对了解模式蛋白识别RNA 的结构过程具有重要意义。核酸适体以及SELEX 技术给蛋白质/ 核酸相互作用研究提供了一种新颖的研究方法，科研人员可以控制筛选条件得到与待研究蛋白质相互结合的核酸适体，避免了天然条件下研究蛋白质/ 核酸相互作用的困难性。但目前对核酸适体与靶蛋白相互作用的分析是在筛选条件与天然条件相同的假设基础上进行的，在这种筛选条件下得到的核酸适体与蛋白质之间的相互作用，和天然状态下的蛋白质/ 核酸之间的相互作用到底有何异同，这是一个亟待解决的问题，此问题的解决必将推动蛋白质/ 核酸相互作用的研究进展。

生物信息学方法

生物信息学是在生命科学的研究中，以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。它包含着生物信息的获取、处理、存储、分配、分析和解释的所有方面。具体地说，生物信息学是用数理和信息科学的观点、理论和方法去研究生命现象，组织和分析呈现指数增长的生物学数据的一门学科。Luscombe和Thornton[8]利用氨基酸序列的保守性构建计算机算法来预测蛋白质/DNA复合体中DNA的结合位点。Selvaraj等[9]将蛋白质/核酸复合体中原子电荷势能作为训练数据集，利用人工智能技术来预测蛋白质对DNA 的识别位点。Ahmad 等[10]将蛋白质的序列组成、可溶解性以及二级结构等信息数据用人工神经网络算法进行训练，构建了在线蛋白质/ 核酸结合预测技术，预测成功率达到了69%。此后Ahmad 和Sarai[11]将此技术进一步加强，在训练人工神经网络时加入了蛋白质进化关系的信息，使预测成功率提高了8.7%。目前建立在蛋白质/ 核酸相互作用基础上的较重要的数据库为蛋白质- 核酸识别数据库()，利用该数据库能帮助研究者了解核酸被蛋白质识别的机制。该数据库包括以下几个组成部分。

2.1　蛋白质-核酸复合物数据库　蛋白质-核酸复合物数据库是一个包含蛋白质- 核酸复合物结构数据的数据库。这些数据根据蛋白质的识别序列和复合物中DNA 形式进行分类。使用者可以通过关键词、识别序列、D N A 形式等进行搜索，并且搜索结果可以直接链接到3DinSight数据库(在此处，可以通过三维结构浏览器，如RasMol 或者VRML 查看含有序列位点和突变位点的三维结构图)。该数据库也能让使用者检测依赖于序列的构象参数和DNA 的柔韧性，并以图表形式显示结果。

2.2　核苷酸-氨基酸相互作用数据库　核苷酸-氨基酸相互作用数据库搜集核苷酸和氨基酸间4 埃大小内的成对原子，能让使用者找到成对的核苷酸和氨基酸。使用者可以指定残基名称( 核苷酸或氨基酸)、原子类型和侧链/ 骨干。搜索后，带有距离值的所有原子对将被显示。搜索可直接链接到3DinSight 数据库，以RasMol 图片形式自动地突出展示复合物结构中所有原子对。使用者可以检测到每个结构中核苷酸和氨基酸的特别相互作用。

2.3　蛋白质-核酸相互作用的热力学数据库(ProNIT)

蛋白质- 核酸相互作用的热力学数据库包含有序列、结构和一些热力学参量(如分裂常数、结合常数、吉布斯自由能的转换、焓和热容量、活性)等信息。该数据库允许使用者用不同条件(多种分类和显示选项)搜索数据。此外，ProNIT 超链接于其他重要的数据库，如PDB、核酸数据库NDB 、酶代码EC、蛋白质信息资源PIR 和ProTherm 等等。当前，在分子生物学和信息科学快速发展的影响下，生物信息学已经成为生物领域的指导科学，利用生物信息学方法研究蛋白质/核酸相互作用可以大大缩短研究工作的时间，达到事半功倍的效果。但受限于当前计算科学和算法领域的发展情况，生物信息学得到的结果与实际的结果还存在一定的偏差，仍需开展进一步的实验工作来进行验证。

生物芯片技术　

生物芯片技术是基于生物大分子间相互作用的大规模并行分析方法，使得生命科学研究中所涉及的样品反应、检测、分析等过程得以连续化、集成化和微型化，现已成为当今生命科学研究领域发展最快的技术之一。目前的生物芯片主要有核酸芯片、蛋白质芯片和糖体芯片等几大类。蛋白质芯片是依靠手工、压印或喷墨的方法将探针蛋白点样在化学膜、凝胶、微孔板或玻片上形成阵列，经过与样品的杂交捕获靶蛋白，再用原子力显微镜、磷光成像仪、光密度仪或激光共聚焦扫描仪进行检测，获得靶蛋白表达的种类、数量及关联等信息。蛋白质芯片已经广泛用于研究蛋白质与核酸的相互作用，已成为一种进行高通量蛋白质与DNA 或RNA作用筛选的有效方法。Ge[12]运用蛋白质芯片检测蛋白质与核酸相互作用，他将包括通用转录因子、激活蛋白和辅激活蛋白在内的48种纯化蛋白质点样在硝酸纤维素膜制成通用蛋白质芯片，用腺病毒主要晚期启动子64 bp 双链DNA 片段、腺病毒主要晚期启动子64 bp 负链DNA 和SV40 早期前体mRNA 杂交，结果证明蛋白质芯片上的所有蛋白质都能够不同程度地特异性识别和结合双链和单链寡核苷酸片段，并且结合双链DNA 和单链DNA 的总体模式基本相同，说明大多数D N A 结合蛋白既能和双链DNA 结合，也能够和单链DNA 结合。蛋白质芯片与RNA 的作用研究表明，蛋白质芯片能够成功地分析RNA 与蛋白质间的识别性结合。蛋白质芯片技术最大优点在于快速和高通量，以往科研人员作研究时一次只能研究少量生物样品，借助蛋白质芯片，一次实验可同时研究大量生物样本，加速了蛋白质/ 核酸相互作用的研究。蛋白质芯片技术目前存在的问题有：(1)蛋白质芯片在制作过程中实验条件发生微小的变化便可能引起最后结果的不同，实验条件不易控制，使得实验结果的可重复性相对不足；(2) 目前用于蛋白质芯片制备的固相介质，如化学膜、凝胶和玻片都存在一些缺点，蛋白质在固相基质表面的固定往往会造成其解折叠，从而失去生物活性；(3)对结果的扫描、去除背景、数据处理等，目前还不能做得很完美，会导致假阳性、假阴性的存在。

纳米技术

纳米技术(nano scale technology) 是一门在0.1~100nm 空间尺度内操纵原子和分子，对材料进行加工、制造具有特定功能的产品、或对某物质进行研究，掌握其原子和分子的运动规律和特性的崭新高技术学科。核酸和蛋白质等生物大分子的大小也是在纳米尺度，随着科学技术的快速发展，越来越多的纳米技术被用来研究生物大分子。在蛋白质/ 核酸相互作用的研究工作中，目前使用较新的技术是利用纳米孔技术来进行研究。纳米孔(nanopore)，可以简单地定义为内径为1~100nm 的微小洞孔，一般孔径应大于洞孔深度，或者处于同一量级。如果孔的深度远大于孔径，就称之为纳米孔道。纳米孔有天然存在的生物纳米孔，也有人工加工的纳米孔。它们都可以用来进行生命科学的相关研究，但是，理想的生物化学或生物物理研究应采用孔径稳定、坚固耐用、物化性能良好的固体纳米孔，这样的纳米孔应该由质地坚硬的固体薄膜材料加工制作。Li等[16]利用聚焦离子束(FIB)制作纳米孔，利用纳米孔将双螺旋DNA 从组蛋白八聚体上剥离下来，并探测这一过程，从而可以揭示核小体中包含的许多生物化学、物理信息。这是由于处于电场中的核小体在电场的作用下，DNA 分子穿越纳米孔，同时由于纳米孔的阻挡力，使组蛋白不能穿越，从而诱使DNA 从组蛋白八聚体上分离下来。通过准确检测DNA 分子穿孔过程中引起的电流阻塞效应，可将DNA 与组蛋白的相互作用的一些性质反映出来。目前已经取得了阶段性的成果。在纳米尺度上研究核酸与蛋白质相互作用，相较于其他的研究方法，优点是能够在生物活性环境中，保持生物大分子受到最少化学修饰干扰的状态下，对生物大分子的空间结构、动态变化、生化特性等进行直接研究。相信该技术可以提供更多、更详细的生物大分子相互作用、蛋白质功能等方面的信息，帮助我们解决一些深层次的生物学疑难问题。目前阻碍此方法广泛应用的一个最大难题是如何在纳米尺度上更好的操纵生物大分子，这需要生物科学、电子科学、材料科学等多学科的共同进展来推动此方法的发展和应用。

braf基因检测15号外显子突变v600e是什么意思?

就是BRAF基因第15号外显子上第600位的氨基酸由缬氨酸（简称为V）突变为了谷氨酸（简称为E），带由这一突变的肿瘤患者对达拉菲尼、维罗非尼这一类的靶向药物敏感。

BRAF 基因突变与消化道肿瘤

【关键词】 BRAF 基因

［关键词］BRAF 基因；基因突变；消化道肿瘤；文献综述

［中图分类号］Q754; R735

近年来，BRAF 基因在肿瘤中的作用越来越受到重视。BRAF 基因编码一种丝/苏氨酸特异性激酶(a serine/theroninespecific kinases) ，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路(MEK: mitogen/extracellular signalregulated kinase； ERK: extracellular signalregulated kinase； MAPK: mitogenactivated protein kinase) 重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等［1］。因此，在以往的研究中，人们对RAF 蛋白功能的关注多集中在将其作为RAS 蛋白关键的效应分子来研究。1988年，Ikawa 等发现该基因能诱导禽原代细胞增殖和NIH3T3细胞的转化，首次确定其为一种癌基因［2］。2002年，Davies 等发现，约66%恶性黑色素瘤和15％的结肠癌中BRAF 基因存在体细胞错义突变［3］。这个令人振奋的发现第一次使人们意识到，在人类肿瘤的发生和发展过程中，BRAF 蛋白可能独立于RAS 蛋白而发挥作用［4］。此后，BRAF 基因引起了人们极大的关注与重视，尤其是该基因的生物学行为和临床意义更是成为研究热点。

1 BRAF 的结构与激活

BRAF 基因是RAF 家族的成员之一，RAF 家族还包括ARAF 和RAF1(CRAF)基因。

BRAF 基因位于7q34，长约190kb ，转录mRNA 长2.5kb ，编码783氨基酸的蛋白，相对分子质量为94000~95000［5］。BRAF 蛋白由783个氨基酸组成，功能上从N 端到C 端为RAS 结合区、富半胱氨酸区(Cys)、甘氨酸环(Gloop)和激活区。在绝大多数组织和细胞类型中，BRAF 是MEK/ERK最为关键的激活因子［68］。它主要有CR1、CR2和CR33个保守区。其中CR1区含RBD 区(ras banding domain ，为RAS 蛋白结合区) 和富含半胱氨酸区(Cys)；CR3区为激酶结构域，含甘氨酸环(Gloop)，为A TP 结合位点和激活区，该区T598和S601两个位点的磷酸化对BRAF 蛋白的激活至关重要。BRAF 蛋白的主要磷酸化位点为S364、S428、T439、T598和S601。BRAF 蛋白的完全活化需要T598和S601两个位点的磷酸化，这两个位点氨基酸的置换将导致激酶持续性激活。此外，该两个位点的磷酸化对于ERK 的BRAF 诱导性激活以及NIH3T3的转化亦很重要［9］。

2 BRAF 突变的类型

研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的BRAF 突变。BRAF 突变主要有两种类型：1.11%位于exon11上的甘氨酸环，如G463、G465、G468等的点突变；2.89％的突变发生在exon15上的激活区，其中约92％位于第1799核苷酸上，T 突变为A(T1799A以前认为是T1796A) ，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E以前被认为是V599E) 。此外，仅不到1％的癌组织同时存在BRAF 突变与RAS 突变，且在这1％中，BRAF 突变几乎均为非V600E 突变。以上两种类型的突变均能使BRAF 激酶活性及NIH3T3细胞转化能力提高，但以后者更为重要。

V600E 突变能模拟T598和S601两个位点的磷酸化作用，使BRAF 蛋白激活［3］。

3 BRAF 突变性激活的生物学效应

BRAF 蛋白激活后导致MEK/ERK的激活，通过转录物或非转录物的方式影响肿瘤进展：在胞浆，ERK 能磷酸化并激活p90RSKs ，继而通过使凋亡诱导因子BRD 失活或激活CREB(cAMP response elementbinding protein，一种能诱导与细胞生存有关基因表达的转录因子) 而影响细胞凋亡［10］。激活的ERK 还能影响肌球蛋白轻链激酶(MLCK)活性，导致组织侵袭和转移。激活的ERK 转位到胞核后能够影响多种恶性肿瘤相关基因的表达：Cyline D 表达增加使细胞生长能自我满足；原凋亡蛋白Bim 家族表达下降使细胞凋亡减少；VEGF(vascular and endothelial growth factor)表达增加促进血管生成；cmyc 表达增加使细胞对抗生长信号不敏感；β3整合素表达增加促进组织侵袭和转移；ERK 还能诱导mdm2的表达，后者能够抑制P53活性。

BRAF 激活后依次激活MEK 和ERK ，ERK 活性增加对黑色素瘤细胞的生物学效应已基本清楚，包括促进细胞增殖和侵袭、改变整合素的表达、降低E 钙黏素表达以及增加基质金属蛋白酶(MMP)分泌［11］，采用RNA 干扰(RNAi)技术抑制BRAFV600E 的表达，能够有效降低MAPK 活性，抑制细胞生长和促进凋亡［12］。将突变的BRAF 基因转染到黑色素细胞中，能使其表型发生恶性转化，将该细胞株接种到裸鼠体内，发现其呈侵袭性生长，并导致肿瘤形成［13］。体内和体外试验均证实，人黑色素瘤细胞株对特异性MEK 激酶抑制剂普遍敏感［14］，针对由BRAF 突变引起的下游信号通路的激活，采用特异性MEK 激酶抑制剂阻断该通路，能够有效抑制鼠恶性黑色素瘤的肺转移，并能使已产生的肺转移灶缩小甚至消失［15］。Houben 等［16］的研究还发现，BRAF 的突变状态与恶性黑色素瘤的预后有关，存在BRAF 突变者预后不良。这些都表明BRAF 突变对于肿瘤的发生、发展有关键性作用，是潜在的诊断标记和治疗靶点。

4 BRAF 突变与消化道肿瘤

近两年来，BRAF 突变与消化道肿瘤关系渐受关注，其中以结直肠癌(CRC)研究最为广泛。现有文献表明，多数消化道肿瘤中均存在不同频率的BRAF 基因突变。除突变类型外，较为一致的是，在同一肿瘤中，BRAF 和Kras 突变具有互相排斥的性质，两者突变从不同时出现，可能是相互独立的遗传事件［1720］。

4.1 结直肠癌

多数报道CRC 中BRAF 突变率在15％左右，且90％以上为V600E 突变，并与Kras 突变负相关［2122］。Nagasaka 等［20］发现9％(21/234)的CRC 存在BRAFV600E 突变，31％(72/234)的CRC 存在Kras 突变，且同一肿瘤中两者从不同时存在。而Ikenoue 等［1,23］认为，在结直肠癌中，BRAFV600E 突变能提高ERK 、NFκB活性和NIH3T3转化能力，但Gloop 区的点突变及D593V 、G595R 等突变则降低激酶活性，对NFκB活性和NIH3T3转化能力无影响。

通常认为CRC 按腺瘤―腺癌的顺序演变而来，但越来越多研究表明可能存在另一条途径，即由齿状息肉包括HP 、MP 、SA 等演变而来。Kambara 等［24］研究发现，在无蒂齿

状腺瘤(SSA)和混合性息肉(MP)中，BRAF 突变较齿状腺瘤(SA)、增生性息肉(HP)和腺瘤(AD)频发；高CpG 岛甲基化表型(CIMP)的齿状息肉和CRC 较CIMP 低或阴性的齿状息肉和CRC 常见。他们认为高度微卫星不稳定(MSIH)的散发性CRC 可能起源于SSA 而非AD 。Chan 等［25］报道，36％(18/50)的HP 、20%(2/10)的MP 、100%(9/9)的SA 存在BRAF 突变，90%(26/29)为V600E 突变。他们推测，HP 向SA 演进可能与BRAF 获得性突变有关，CRC 可能循HPSA 腺癌演变而来。

此外，Yuen 等［17］研究还发现，BRAF 突变与结直肠癌分期显著相关(Dukes’A、B 期C、D 期) ，且具有统计学差异，但与性别、年龄、肿瘤分化状态、部位无关。

4.2 胰腺癌

最近的两项研究发现，在胰腺癌临床标本和胰腺癌细胞株COLO357中均能检测到BRAF V600E突变［2627］。Calhoun 等［27］检测了9例Kras 野生型的胰腺癌组织，发现3例含有BRAF V600E突变，突变率为33%(3/9)，而在74例含Kras 突变的胰腺癌组织中则未检测到BRAF 突变，且在BRAF 和Kras 均为野生型的胰腺癌组织中均未发现其信号通路成员MEK 、ERK 、RAP1B 等的突变。

4.3 胃癌

在胃癌的发生、发展过程中，BRAF 突变是稀有事件。Wu 等［28］检测了16例胃癌细胞株和62例胃癌组织标本BRAF 和Kras 的突变情况，发现无一例细胞株存在BRAF 突变，仅1例胃癌组织存在BRAFV600E ，而31％的细胞株及1.6%的组织标本存在Kras 突变。 Oliveira 等［19］发现，124例微卫星稳定性(MMS)胃癌仅1例存在V600E 突变。37例MSI 胃癌无一例突变，但Kras 突变频率较高，提示BRAF 突变可能与胃癌的发生无关，而Kras 突变可能与伴DNA 错配修复(MMR)缺陷的胃癌的发生有关。

4.3 其它

在其它类型的消化道肿瘤方面，Tannapfel 等［29］认为BRAF 突变在胆管癌(CC)中较常见，而在肝细胞癌(HCC)中少见，CC 中BRAF 和KRAS 的突变率分别为22％(15/69)和45％(31/69)，且两种突变不同时出现在同一CC 中。而25例HCC 均未检测到RAF 和Kras 突变。Blaker 等［30］发现在21例散发性小肠腺癌中13例存在突变，12例为Kras 突变，1例为BRAF 突变，他们认为在小肠癌的发生发展过程中，RASRAFMEKERKMAPK 通路的激活常由Kras 突变引起，偶由BRAF 突变引起。Perren 等［31］检测了130例胰腺、胃肠道、肺等内分泌肿瘤中BRAF 的突变情况，发现47％的乳头状甲状腺癌、1例分化良好的胃肠道内分泌癌存在V600E 突变，而其它肿瘤中则未发现。

5 结束语

如前所述，BRAF 突变状态与多种肿瘤的发生、发展及临床结局有关，可能是一种新的恶性肿瘤相关基因、一个新的基因治疗靶点。就消化道肿瘤而言，虽然现有研究证实存在不同频率的BRAF 突变，但由于对BRAF 突变的研究只有短短几年时间，尚缺乏大规模、系统而深入的研究，仍然有很多问题需要进一步阐明。例如BRAF 突变率和突变类型究竟怎样；BRAF 获得性突变是否发生在肿瘤进展过程的早期阶段，究竟是否具有确切的病理学意

义，是否是良性肿瘤恶变的先兆；BRAF 突变的生物学效应及其分子机制，其与消化道肿瘤发生和发展的关系；除V600E 突变外，其它类型的突变是否具有相应的生物学效应；在细胞周期调控过程中，是否象其它癌基因一样，需要“二次打击”；能否通过干预BRAF 突变来治疗消化道肿瘤等这些问题仍有待进一步论证。但BRAF 作为一种癌基因，BRAF 蛋白作为一种重要的信号转导分子，在细胞内参与广泛的细胞事件，其重要性是无疑的。对BRAF 突变研究的深入，必将丰富现有对恶性肿瘤分子机制的认识，可望为阐明消化道恶性肿瘤致病的分子机制，寻找新的治疗途径与靶点提供思路，为有效干预消化道肿瘤、降低患者死亡率提供理论依据。

新冠病毒变异未明显影响中国疫苗有效性，这能说明什么？

新冠病毒发生了一定的变异，但变异并没有影响我们疫苗的有效性证明变异仍然是在可控的范围之内的，它虽然有了点变化，但是它的本质没有改变，所以我们研究的疫苗仍然是有效的，并不会需要担心接种疫苗之后如果病毒变异不管用的问题。

目前没有有效的数据能够证明病毒变异之后，它本身能够抵抗注射疫苗所产生的有效抗体，因为他们两个本质上来说是同根同源的兄弟，只是说这个灭活疫苗是我们通过特殊的手段提取出来的，注入人体的免疫系统，它对人体不会有伤害，但是信息是在保留的，然后人体的免疫系统识别到这个信息，就会储备一部分的抗体真的有这个病毒进入的时候，就会起到快速应对以及杀灭的效果。

人体的免疫系统说强大也强大，说脆弱也脆弱，因为它在各方面都保持着一个中等的数值，也就是说现在很多疾病，就包括人类现在束手无策的癌细胞之类的，在人体的免疫系统之下都是可以杀灭的，就是说人体免疫系统如果有效的识别到了这些信息，数量不是特别多的情况下，都可以自行杀灭人类束手无策的东西，人的免疫系统都可以解决，只是说他对抗不了突发性的，对抗不了识别不出来信息的这种病毒或者细胞。

现在全国各地都在逐渐推进疫苗注射的相关工作，可以说疫苗的注射普及是一个大的趋势了，我们必须得有足够多的人接种，才能建立起一道疫情防控的防线，我国有14亿人口，预计有10亿人接种的时候，也就是达到70%左右的这个疫苗接种率，我们就可以建立起一道有效的防线去抵抗病毒，就几乎不会再发生那种大规模传染的情况了，但现在接种的这个比率还是没有那么理想。

奥密克戎BA.2.12.1变异株进入广东，该变异株有什么特点？

一架从肯尼亚内罗毕起飞的国际航班KQ880抵达广东省广州市白云国际机场，所有旅客均被转移至隔离酒店进行常规医学观察和常规核酸检测。

奥密克戎BA.2.12.1，变异传播非常迅速

其中一名27岁的中国男性于4月27日报告新冠病毒核酸阳性。他全程接亚变异传播非常迅速，导致美国许多地区重新流行，至少有17个国家报告了病例。确诊后，他被转至广州医科大学附属市八医院接受治疗。该患者的鼻拭子样本基因测序显示，他感染的是奥密克戎亚型毒株BA.2.12.1。在刺突基因上共检测到33个氨基酸突变位点，其中L452Q和S704L为BA.2.12.1亚谱系的关键位点。

BA.2.12.1的传染性增强，且增加了免疫逃逸能力

中国疾控中心流行病学首席专家吴尊友曾表示，奥密克戎毒株BA.1的传播速度比德尔塔毒株增加约70%多，而BA.2又比BA.1传播速度高出了60%多。中疾控在5月16日的周报指出，BA.2.12.1亚型的传播速度比BA.2亚型还要再快约23%至27%。

结束语

BA.2.12.1是BA.2变异株的下一代。相比起BA.2变异株“爸爸”，BA.2.12.1“儿子”出现了两个新的突变——L452Q和S704L，其中最关键的是L452Q。L452Q位于新冠病毒S蛋白的RBD（受体结合域），这是新冠病毒与宿主细胞ACE2受体结合的位置。德尔塔变异株有一个发生在同一位置的突变L452R，正是这一关键变异提高了德尔塔毒株侵入细胞的能力，使得它的传染性增强，且增加了免疫逃逸能力。

L452Q也可能具备相同的作用，使得BA.2.12.1更容易发生突破性感染。在原始的奥密克戎变异株出现的时候，并不携带L452突变，但在BA.2.12.1上，这一突变又“杀回来”了。因此BA.2.12.1可以说是叠加了奥密克戎与德尔塔的传播优势。

中疾控的周报指出，与其他奥密克戎亚型相比，BA.2.12.1亚型在接种疫苗加强针后，仍具有更强的免疫逃逸能力。同样值得关切的是在南非发现的奥密克戎亚型变异株BA.4与BA.5。这两个亚型同样存在L452突变，与德尔塔在这一位置的突变一模一样，因此都表现出了显著的免疫逃逸能力。

英国发现的新冠病毒变种再次发生突变意味着什么？

英国发现的新冠病毒变种再次发生突变意味着什么

国内一位免疫学专家3日在接受《环球时报》记者采访时表示，E484K突变代表的含义是新冠病毒的基因发生突变，导致其编码蛋白的第484位氨基酸残基从谷氨酸（E）变成了赖氨酸（K）。武汉大学医学部病毒所教授杨占秋3日对《环球时报》记者表示，E484K突变表示这次突变是在病毒的一个位点发生的。去年年底英国发现的被命名为B.1.1.7.的变异病毒株则出现了前所未有的17个突变。

不过从病毒进化史来看，变异时时刻刻都在进行。去年12月，英国公布发现新冠病毒变异后，张文宏对此进行解释称，病毒在传播中不断出现变异是其生存进化的自然现象。他认为，新冠病毒成千上万的突变已经出现，但只有极少数可能是重要的，并以可察觉的方式改变病毒。但张文宏认为，突变可用于病毒的传播路径和疫情暴发监测，和致病性或传播力是否增强没有必然因果关系。上述免疫学专家也认为，从目前看，新冠病毒像其他RNA病毒一样，容易出现突变，但大多数突变没有改变传播能力和致病能力。

那么新冠病毒什么样的变异才会引起比较严重的后果？上述免疫学专家表示，一般来说，突变发生在病毒关键抗原表位或与其生理活动，比如结合受体、复制活性等有关的分子时，可能会改变感染或致病能力。而判断变异是否严重，只能通过实验研究，特别是流行病学和循证医学的证据。

杨占秋则认为，目前媒体披露的信息有限，不足以全面判断此次英国发生的病毒再次变异所产生的影响。他认为，除了突变点位之外，还需要结合突变发生部位，如果发生在病毒关键的致病点位引起氨基酸改变才会有意义。