氨基酸偶联物(ADC定点偶联技术｜工程化突变非天然氨基酸偶联技术)

氨基酸偶联物

定向偶联抗体

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传统的ADC利用抗体赖氨酸的氨基或打开链间二硫键获得的半胱氨酸的巯基进行偶联，赖氨酸的氨基与活化的羧酸酯连接子通过酰胺键连接，半胱氨酸的巯基与马来酰亚胺基团反应，其偶联示意图如图1所示。一个抗体分子包含了80~ 90个赖氨酸，偶联可能会发生在将近40个不同赖氨酸残基上，打开链间二硫键会得到多个半胱氨酸残基，同时破坏了抗体分子的完整性，因此传统的ADC是高度异质混合物，其均一性差（即药物与抗体的比率 (DAR)为1-8），稳定性低，影响药效及治疗窗。

定点偶联技术可以实现抗体与小分子毒素定点、定量偶联，通过该技术获得的ADC具有合适的药抗比DAR，均一性高，稳定性好，批次间重现性高，具有更好的活性和药动学特性，同时也更适用于ADC的大规模生产。

图1 非定点偶联示意图

本系列将对定点偶联技术在ADC开发中的应用进行总结。本文作为系列第一篇，将对定点偶联技术之工程化突变非天然氨基酸偶联技术进行概述。

01 工程化突变非天然氨基酸偶联技术

天然氨基酸中可用于偶联的氨基酸只有赖氨酸和半胱氨酸，非天然氨基酸可被构建到重组蛋白中，获得可与小分子药物发生化学反应的残基侧链。因此非天然氨基酸为ADC的开发提供了一个新的技术手段。通过非天然氨基酸可以实现抗体-药物位点特异性偶联。蛋白质在核糖体上的合成通过tRNA反密码子与mRNA密码子识别来进行。Ambrx公司引入可特异性识别非天然氨基酸的tRNA和与之相对应的氨酰tRNA合成酶，在氨酰tRNA合成酶的作用下，tRNA与对应的非天然氨基酸结合形成氨酰tRNA，再通过其反密码子与mRNA上的密码子互补，使非天然氨基酸被整合到多肽链中，合成含非天然氨基酸的重组抗体。

图2 将非天然氨基酸插入重组抗体中

引入的非天然氨基酸通常为乙酰苯丙氨酸（1）、叠氮基甲基-L-苯基丙氨酸（2）和叠氮赖氨酸（3）。非天然氨基酸上带有的酮基、叠氮基官能团可与药物连接子发生化学反应，获得DAR均一的ADC。酮基可与羟胺基团形成肟键（见图3A），叠氮基团可与炔基在铜的催化下形成1，2，3-三唑的环加成反应（见图3B），叠氮基团还可以在没有铜催化的情况下与环辛炔结合，发生叠氮-辛炔环加成反应（见图3C）。

图3 引入非天然氨基酸的定点偶联

02 相关技术平台

XpressCF+? Platform

Sutro Biopharma总部位于旧金山南部，是一家临床阶段的肿瘤学公司，致力于开发位点特异性和新型抗体药物偶联物(ADC)。Sutro开发了位点特异性结合平台XpressCF+，可以在抗体结构中几乎任何位点精确地结合非天然氨基酸（nnAA），从而允许连接子和弹头位点特异性偶联单种类ADC。在此过程中至关重要的是，Sutro能够利用大量不同的位点对众多变体进行快速和平行的合成，从而能够在发现早期进行分析，以定义构效关系并根据以下条件定位nnAA掺入的最佳位置：

• 位点特异性的ADC技术

抗体表达

nnAA的掺入效率

• 优化的Linker/Warhead

Linker/Warhead共轭效率

在患者体内循环时稳定的连接弹头

• 治疗指标/安全性

细胞杀伤效率

目标靶向效率

内化特征

ADC的细胞杀伤效果取决于弹头的位置和药物与抗体的比例（DAR）。Sutro可以精确地控制这两个变量，从而产生真正优化的候选产品。为了提高偶联效率和由此产生的位点特异性载药量，Sutro设计并合成了优化的含叠氮化物nnAA-叠氮甲基-L-苯丙氨酸 (pAMF)，与PAzF相比，它可以实现更快速的共轭动力学。

图4 叠氮化物-炔烃环加成 (SPAAC) 反应动力学

Sutro成功地利用高通量筛选平台OCFS（Open cell free synthesis），将亚氏甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶特异性定向到pAMF。这种aaRS-tRNA-nnAA 组合和无铜点击偶联化学能够生产均质ADC，其药物抗体比 (DAR) 值接近每个抗体两种药物的理论极限。该平台将能够对任何候选ADC支架的结合位点、载药量和功效之间的关系进行快速和详尽的分析。由于表达平台的高度可扩展性，可以快速大量生产ADC先导候选物。使用这种方法生产的ADC可以产生更活跃和多样化的药品，并且由于优异的产品同质性，为监管分析和制造提供了显著优势。

图5 pAMF TyrRS变体产生具有高DAR值的强效ADC

03 产品布局

Sutro利用该技术平台研发了Stro-001 与Stro-002，目前这2个ADC均处于Ⅰ期临床试验状态。

Stro-001 在每个重链上的F404位置都含有2个对叠氮苯丙氨酸（pAMF）残基，定点偶联2个连接子-毒素，其采用了不可裂解的二苯并环辛（DBCO）-美登素作为连接子-毒素。Stro-001是一种靶向CD74的ADC，目前处于I期临床研究，评估治疗晚期B细胞恶性肿瘤，包括多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。在2018年10月，FDA授予Stro-001治疗多发性骨髓瘤的孤儿药资格。

2021年10月12日，烨辉医药宣布与Sutro Biopharma签署了授权协议，Sutro授权烨辉医药在大中华区（包括中国大陆、香港、澳门和台湾）开发和商业化靶向CD74的抗体偶联药物(ADC)STRO-001，用于治疗血液癌症患者。

Stro-002 在每个重链上的Y180和F404位置都含有4个pAMF残基，从而达到定点偶联4个连接子-毒素的目的。其采用一种新型的连接子-毒素SC239，SC239由以微管蛋白为靶标的3-氨基苯基半胱氨酸弹头（SC209）和用DBCO功能化的一种可裂解的缬氨酸-瓜氨酸对氨基苄酯连接子构成。DBCO对pAMF残基的快速选择性反应保证了ADC的均一性，使DAR 值保持在4。

STRO-002的靶点FRα具有肿瘤细胞特异性，在卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌和非小细胞肺癌等肿瘤组织中高表达，在正常组织中不表达或者表达量非常低，因此靶向FRα有望特异性治疗包括卵巢癌、非小细胞肺癌（NSCLC）、乳腺癌和子宫内膜癌等多种实体瘤。值得一提的是，FRα为竞争较少但有明确成药可能的ADC靶点，可避免同质化竞争，形成差异化优势，目前全球尚无靶向FRα的ADC产品获批上市，临床阶段产品共3个ADC产品，STRO-002是目前唯一在临床试验中不区分患者FRα表达水平的产品，有成为同类最佳“best-in-class”的潜力。

2021年12月24日，天士力医药集团股份有限公司（600535.SH）宣布控股子公司天士力生物医药股份有限公司（以下简称“天士力生物”）获得美国Sutro独家许可，在区域内（即中国大陆、香港及澳门特别行政区、台湾地区）独家开发、注册、商业化一种靶向叶酸受体α（FRα）的抗体偶联药物（Stro-002）。根据许可协议约定，天士力生物将向Sutro支付4000万美元首付款和潜在最高3.45亿美元的开发及商业化里程碑付款，以及约定比例的销售额提成。天士力生物将在Sutro的协助下实现无细胞蛋白合成、非天然氨基酸定点偶联等一系列领先技术在合作区域的技术落地生产。

2022年6月28日， Sutro和安斯泰来宣布了一项全球战略合作和许可协议，重点是发现和开发新型免疫刺激性抗体-药物结合物（iADCs）。这项合作利用了iADCs作为一种新型模式的独特抗癌潜力，通过Sutro设计复杂共轭抗体的能力和安斯泰来的全球肿瘤学研发能力来实现。这次合作，也充分反映了Sutro在ADC领域布局的技术先进性以及拥有的巨大潜力。

04 小结

引入非天然氨基酸的抗体与药物连接子可定点、定量偶联，获得DAR均一、药效高、稳定性好、安全性高的ADC，但也存在抗体表达困难，易产生免疫原性的弊端。

挑战一：大规模商业化生产重组抗体

与仅含有 20 种天然氨基酸的蛋白质相比，含有非天然氨基酸的重组蛋白质的商业生产必然面临额外的挑战。具体挑战主要包括优化tRNA合成酶活性、需要构建能够提供足量的tRNA合成酶底物的细胞系。

挑战二：潜在的免疫原性

免疫原性是任何抗体治疗的潜在问题，包括全人源单克隆抗体。人体免疫系统并非能够识别 “天然”与“非天然”，而是能够识别“自身”与“非自身”。因此自身蛋白中的任何氨基酸变化都可以在MHC分子上产生新的免疫原性肽，并刺激T细胞反应。

总而言之对于该领域的探索还在验证中，对于利用该技术平台的相关产品安全性和有效性也有待我们进一步跟踪，拭目以待吧。

参考文献：

[1] Hallam T J, Smider V V. Unnatural amino acids in novel antibody conjugates[J]. Fut Med Chem, 2014, 6(11): 1309-1324.

[2] Xu Y, Jiang G, Tran C, et al. RP-HPLC DAR characterization of site-specific antibody drug conjugates produced in a cell-free expression system[J]. Org Process Res Dev, 2016, 20(6): 1034-1043.

[3] Wang L, Brock A, Herberich B, et al. Expanding the genetic code of Escherichia coli[J]. Science, 2001, 292(5516): 498-500.

[4] Hallam T J, Wold E, Wahl A, et al. Antibody conjugates with unnatural amino acids[J]. Mol Pharmaceutics, 2015, 12(6): 1848-1862.

[5] Hutchins B M, Kazane S A, Staflin K, et al. Site-specific coupling and sterically controlled formation of multimeric antibody Fab fragments with unnatural amino acids[J]. J Mol Biol, 2011, 406(4): 595-603.

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