氨基酸的测定原理
蛋白质的颜色反应实验
一、实验目的
ü 了解蛋白质的基本结构单位及主要连接方式
ü 了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理
ü 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法
二、实验原理
v 双缩脲反应
? 两分子尿素加热到180℃左右时，生成双缩脲并放出一分子氮，双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应
? 蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应，因此该反应可用于蛋白质的定性或定量测定
v 茚三酮反应
? 所有的α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质，除了脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质
? 该反应十分灵敏，是一种常用的氨基酸定量测定方法
? 该反应分为两步：第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮结合另一分子水合茚三酮和氨缩合生成有色物质
v 黄色反应（Pauly反应）
? 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠
? 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应
v 考马斯亮蓝反应
? 考马斯亮蓝G-250具有红色和蓝色两种色调，在酸性溶液中其以游离态存在，呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色
? 考马斯亮蓝G-250染色灵敏度比氨基黑高3倍，反应速度快，约在2min左右时间内达到平衡，室温1h内保持稳定
? 在0.01～1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595nm值成正比，所以常用来测定蛋白质的含量
三、实验器材
? 试管及试管架，试管夹，酒精灯，滴管，电炉，滤纸
四、实验材料与试剂
? 尿素，10％NaOH溶液，1％CuSO4溶液，2％卵清蛋白溶液，0.5％甘氨酸溶液，0.1％茚三酮水溶液，0.1％茚三酮乙醇溶液，鸡蛋清溶液，头发，指甲，0.5％苯酚溶液，浓硝酸，0.3％色氨酸溶液，0.3％酪氨酸溶液，考马斯亮蓝G-250溶液
五、实验操作
v 双缩脲反应
? 取少量尿素结晶，放入干燥的试管，微火加热使尿素熔化，熔化的尿素开始硬化时停止加热，尿素放出氮，形成双缩脲
? 冷却后，加入1mL 10％NaOH溶液，振荡混匀，再加入1滴 1％CuSO4溶液，振荡，观察实验现象
? 向另一支试管中加入约1mL 2％卵清蛋白溶液和约2mL 10％NaOH溶液，摇匀，再加入2滴1％CuSO4溶液，随加随摇，观察实验现象
v 茚三酮反应
? 取2支试管，分别加入2％卵清蛋白溶液和0.5％甘氨酸溶液各1mL，再各加0.5mL 0.1％茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1～2min，观察实验现象
? 在一块小滤纸上滴一滴0.5％甘氨酸溶液，风干后，在原处滴一滴0.1％茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察实验现象
v 黄色反应（Pauly反应）
? 取6支试管，按下表加入各试剂：
? 观察各管的现象，若反应较慢，可略微放置或用微火加热
? 待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10％NaOH溶液至碱性，观察颜色变化
v 考马斯亮蓝反应
? 取2支试管，按下表加入各试剂：
? 观察实验现象，并解释
六、实验思考
? 通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法？它们的原理是什么？
蛋白质的性质实验——蛋白质及氨基酸的呈色反应,蛋白质的颜色反应实验
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