氨基酸液质联用法
高效液相色谱与经典液相色谱
本周二，实验与分析平台特别邀请了南京海关动植物与食品检测中心 液相液质检测组组长张健老师与小伙伴分享了高效液相色谱方法开发、常见故障与维护（课程链接：http://zhibo.vogel.com.cn/watch/5201868），得到小伙伴们的热烈欢迎，强烈小析姐把课程内容整理成文章分享给大家，所以小析姐把当天的内容内容以及小伙伴们的问题进行了汇编，分享给大家，希望对你的工作学习有所帮助。
HPLC是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段。广泛应用于各个领域：医药，环保，石化，生命科学，食品，农业等领域，无论在技术上，理论上，还是在应用上仍有较大的发展空间: 超高压液相色谱(UPLC)的创立
HPLC原理
溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
HPLC的分类
HPLC的组成
主要组成部分如下：
? 输液系统
? 进样系统
? 分离系统
? 检测系统
? 数据处理系统
1、输液泵
（1）四元泵
? 流动相选择更为灵活
? 结构简单，故障率低
? 对脱气要求高
? 不易调节梯度的滞后体积
（2）二元泵
? 低流速下（<0.2mL/min），有更好的流量精度和混合精度
? 可以不使用脱气机
? 溶剂切换不灵活
泵系统为输液系统中最为核心部分，也是整个液相色谱系统中最为核心的部分
2、脱气机
原理：溶剂瓶中的溶剂在 LC 泵的抽取下流过真空箱内的特殊管状塑料膜。当溶剂经过真空管时，溶剂中溶解的气体将渗过塑料膜进入真空箱。当溶剂离开真空脱气机的出口时，几乎已被完全脱气。
输液泵-洗脱模式
（1）等度洗脱
等度洗脱：用恒定配比的溶剂系统的洗脱方式
优点：简便、重复性好。
缺点：对于成分复杂的样品，效果不佳。
（2）梯度洗脱
3、进样系统
进样方式分为自动进样系统（是否带温控）和手动进样
系统核心部件：六通阀
取样时，流动相直接进柱，进样口与定量管连接，样品充满定量管后，多余样品从6流出。
进样时，泵将流动相压入定量管，将样品全部进入色谱柱分析。
带有清洗模式的六通阀进样系统，清洗包括：注射器、定量环和进样针外壁。
进样系统还包括样品盘室控温功能避免样品快速挥发。
4、分离系统
液相色谱柱是整个HPLC系统的分离核心。
化学键合相色谱柱：70%将不同的官能团通过化学反应键和到硅胶表面的游离羟基上，而形成化学键和固定相，进而形成化学键和相色谱柱。反相：C18, 65%; C8, 15%; 反相色谱是目前应用得最为广泛的高效液相色谱方法。正相：20%;-NH2、 -CN其它 (手性柱， 离子交换柱)：10%
聚合物基质柱（ eg.聚苯乙烯柱）单独的聚苯乙烯类填料柱主要用于分离蛋白质类等大分子化合物，多用于GPC、GFC、MEC等；若与离子交换基团共键则形成离子交换柱，用于分离酸性化合物（磺酸基团）、碱性合物（季铵基团）及药物代谢产物等。
特点：
? 在1＜PH＜13的流动相中稳定；
? 分离峰形较好，柱子寿命较长。
其他无机物填料柱如氧化铝、石墨化碳、氧化锆、硅藻土等，主要作制备色谱用。
柱温箱
? 控制温度，保证分析结果重现性；
? 升高温度，降低了流动相的黏度，降低柱压，保证色谱系统的稳定性
某些情况，提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）
5、检测器
检测器分类：
药典中，紫外检测器（VWD）占比74%；二极管阵列检测器（DAD）占比23%；蒸发光散射(ELSD)占比3%
（1）检测器-紫外
原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波长可变和光二极管阵列三种类型。
定量基础：Lambert-Beer定律，A＝Kbc
优点：
? 选择性检测选择性检测器、波长检测范围：190-800nm ；
? 对流量和温度敏感性低、灵敏度较高；
? 应用最广，对大部分有机化合物有响应；
? 对流动相的流速和温度变化不敏感；
? 波长可选，易于操作；
? 可用于梯度洗脱。
缺点：
? 由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用检测器；
? 受流动相组成的影响。
用截止波长以上至少5～10nm作为工作波长，缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响
? 背景吸收降低了线性范围
? 多数流动相有紫外吸收
（2）检测器-二极管阵列（DAD）
光电二极管取代了传统的光电倍增管，在一次色谱操作中可同时获得多波长的吸光度，并且可以采用现代微机技术将各组份的保留时间、吸收波长和吸光度汇合一起，绘制三维谱图，提供既定量又定性的色谱信息。
光谱信息的作用：
? 提供定性依据
? 纯度鉴定
（3）检测器-荧光（FLD）
发荧光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子达到激发态，其返回到基态时发射光的现象即荧光，共轭及芳香族化合物最容易有荧光现象。
原理：某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光）的性质检测。
优点：
? 选择性好、灵敏度高（10-12g）、对流量和温度敏感性低。
缺点：
? 不是所有化合物都有荧光，需要衍生;
? 检测器对溶解气体及其他淬灭物质（如甲醇）敏感;
? 对Ex及Em的最佳波长，易受温度、溶剂的极性和粘度、溶剂的pH值及样品浓度影响。
（4）检测器-示差（RID）
原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度的检测器。
优点：
? 通用检测器
? 容易使用；
?通常来说是比较耐用的检测器；
? 维护成本低
缺点：
? 灵敏度低、选择性差；
? 对流速、温度及粘度的变化敏感；
? 不能用于梯度方法；
? 色谱峰可能是正的，也可能是负的。
典型的应用领域没有紫外吸收、荧光的化合物，例如：碳水化合物、聚合物、脂肪酸及油脂类。
a.温度对于RID的影响
b.流动相梯度对于RID的影响
RID温度变化要保持在±0.001℃，且不能用于梯度检测
（5）检测器-蒸发光散射（ELSD）
原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气（氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。
优点：
? 可以作梯度实验；
?检测下限可到纳克级水平；
? 对环境条件不敏感；
? 可以使用有强紫外吸收的溶剂作流动相。
缺点：
? 不能使用不挥发性的流动相（例如：磷酸盐）；
? 破坏性技术；
? 对挥发性化合物的检测不理想；
? 一般得到的是非线性校正曲线；
? 某些化合物的检测灵敏度不如其他检测器。
应用领域：碳水化合物、油脂及脂肪酸、未衍生的氨基酸制药行业、表面活性剂、天然产物
建立HPLC方法的基本步骤
1、分离条件的的建立及优化
（1）样品前处理
? 最好使用流动相溶解样品。
? 使用预处理除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
? 使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
要考虑的因素：
? 要分离的化合物/样品的化学特性；
? 化学结构、分子量及紫外光谱等等；
? 流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等）；
? 梯度还是等度；
? 灵敏度需求；
要考虑的因素：
? 流动相的选择；
? 色谱柱的选择；
? 流速、洗脱模式；
? 方法微调和优化；
流动相
性质要求：一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
pH：对于应用广泛的反相色谱，通过调节流动相的pH值，抑制样品组分的解离，能增加组分在固定相上的保留，并改善峰形。
2、流动相
对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在;对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液;分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。
缓冲盐有助于增加方法的可靠性，促进色谱峰的尖锐性常用缓冲盐包括磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐
3、校正定量方法
HPLC常见故障与原因分析
HPLC的日常维护
1、流动相
? 水相和缓冲盐应储存在棕色玻璃瓶，以避免藻类的生长；
? 流动相应经过0.45um或更小孔径的滤器过滤；
? 水相和缓冲盐应及时更换，一般使用不超过两天；
? 定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶，每三个月至少清洗一次。
? 玻璃溶剂过滤器（不能超声）可以放在35%硝酸溶液中浸泡；
? 金属过滤器不能用酸浸泡，可以放置在甲醇溶液中超声清洗。
2、泵组件
3、柱塞清洗系统（seal wash）
? HPLC使用缓冲溶液Buffer时，由于缓冲盐溶液存在高压盐析现象，析出的细小盐粒会损伤蓝宝石柱塞杆和密封垫，从而造成漏液等故障现象，因而建议选配柱塞清洗附件Seal Wash。
? 缓冲盐浓度大于0.01mol时，强烈建议选配在线的柱塞清洗附件Seal Wash。
? 清洗液配置：90%水+10%异丙醇溶液，流速为2-3滴/min。该混合液可抑制菌类生长和降低水的表面张力。清洗液虹吸流出，不能干涸。
仪器配备了柱塞清洗系统，如果日常使用并不涉及缓冲盐，也须始终保持seal wash 管路充满液体，否则会增加柱杆活塞运动的阻力，损坏柱塞密封组件和柱塞杆。
4、检测器
（1）UV检测器
如果流动池被污染可先用以下方法处理：在不连接色谱柱的情况下先用高纯水冲洗20分钟，然后用5％硝酸冲洗2小时，最后再用高纯水冲洗至流出液中性即可。
? 述方法不果，就需更换流动池的检测窗。
? 上述处理方法也适用于DAD的流动池。
（2）荧光检测器
由于水性流动相长时间留在流动池会有藻类生长，而藻类会产生荧光，所以可添加有机溶剂如5％的乙腈或甲醇。
如怀疑流动池被污染可用以下步骤清洗之：
a. 用双蒸水冲洗30分钟以上；
b. 用注射器注射65％硝酸入流动池并使其留在流动池约1小时；
c. 用双蒸水冲洗干净。
检测器中有硝酸时，不要使用泵或者HPLC其他组件，否则硝酸会腐蚀HPLC系统组件，同时在冲洗过程中不要超出20bar
5、色谱柱
进行色谱柱再生时，应使用一个廉价的泵，最好不使用高效液相色谱仪上的泵。
色谱柱再生方法：
极性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色谱填料）的再生：正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水** 。
非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱。
注意：
在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。
**如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。
? 过滤所有的溶剂和样品；
? 使用保护柱；
? 仪器在使用完毕，要冲洗整个系统，移走系统中的缓冲液。
? 柱子在不使用时，两端密封保存；
? 在适当的溶剂中保存柱子；
? 注意色谱柱的pH值使用范围；
? 不要高压冲洗柱子。
6、其他
◆ 正相色谱、反相色谱切换时应使用IPA过渡，长期使用正相，应更换正相柱塞密封垫；
? 样品进样之前最好过滤，如果样品量太少，可以适当抬高进样针的位置；
? 注意不同检测器流通池耐压问题，尽量避免使用pH>9.5的流动相，以防腐蚀流通池石英窗，避免使用可能**的流动相，防止流通池堵塞；
? 不同检测器最大耐压：VWD 40bar 、 DAD 60bar、 FLD 20bar 、 RID 5barRID永远是最后一个检测器。
网友问题精选
1、色谱柱干了还能用吗？
答：色谱柱干了可以通过再生继续使用的，利用全有机相，例如，甲醇、乙腈等溶液，低流速排除柱子内的气泡，在这里不建议使用纯水冲洗，纯水的排气效果远远比不上有机相的效果。
2、四元泵和二元泵有什么区别呢？
答：四元泵有一组泵和一个比例阀，通过控制比例阀控可以制四个通道，调节四个通道的溶液比例。二元泵有两组泵，每组泵控制一个通道，因此只能控住两个通道。
3、玻璃过滤头25％硝酸浸泡，是否需要过夜？
答：当使用35%的硝酸浸泡时，只要1个小时就可以达到目的效果，当使用20%的硝酸时，过夜的效果会更好一些。
4、正相柱塞杆可以用于反相色谱吗？
4、答：当使用反相色谱要切到正相时，正相为叔丁基甲醚、四氢呋喃等极性比较小的流动相时会对反相色谱的柱塞密封圈产生腐蚀作用，如果经常使用诸如此类流动相时，还是要把反相色谱的密封垫进行更换。
5、安捷伦1260-II的仪器经常出现自动进样器针座压力高，是怎么回事？
答：如果流动相是过滤使用的，进样器针座经常压力高，意味着样品里有未溶解的杂质，可以通过重新选取滤膜进行解决。冷藏或者静置也会起到一定的沉淀作用。
6、峰形不好的原因有哪些？
答：液相峰形不好的原因有很多，首先，最好选用流动相溶解样品，避免溶剂效应；其次，有可能是流动相的PH值不当，建议使用缓冲盐；此外，进样量、色谱柱老化也会影响峰形。
7、老师，色谱柱堵了，一般如何解决
答：色谱柱堵塞绝大部分会发生在柱头，有条件的情况下，可以将柱头筛板拆卸下来，进行超声清洗，或者将色谱柱进行短时间反接冲洗。
8、如果检测物质的标样是用甲醇定容，而样品是用水前处理，标样与样品上机检测，是不是峰型与保留时间会有差距？
答：有可能会产生溶剂效应，溶剂效应最明显的特征就是峰前延，所以对峰形会有影响，对保留时间影响不大，如果检测物质的响应足够高，可以通过减少进样量，降低溶剂效应，进而改善峰形。
9、分析柱和保护柱的区别，保护柱怎么用？
答：保护柱的主要作用是将流动相中的颗粒杂质留在保护柱内，对于高酸、高碱的流动相，有填料的保护柱也可以保护色谱柱填料。相比于分析柱，价格会便宜很多。
10、流动相如果跑空了，会有什么后果呢？怎么解决呢？
答：在整个色谱系统中都会气泡进入，解决办法就是排气泡，进行系统冲洗。
11、饲料产品中不进行前处理提取，直接用甲醇定容，可以吗？
答：饲料基质会含有许多成分，例如，高蛋白，如果直接用甲醇定容，效果不是很好，不过还是要由分析的物质决定。
12、二元泵柱塞杆串联和并联有什么区别，哪种更好？
答：二元泵柱塞杆串联有串联模式，但现在实验室里大部分二元泵都是并联模式的。
13、老师，泵压会随气温变化影响吗？
答：我们知道温度越高，流动相的粘度就会越低，因此，系统压力会相应的减小。
14、用硝酸清洗流通池的时候，怎么能不经过泵啊？怎么操作的啊？
答：可以利用注射器吸取35%的硝酸溶液，将硝酸溶液直接打进流动池。
15、手动进样，定量环20微升 怎么进5微升？
答：无论是手动进样还是自动进样，定量环只有两种进样方式：满环进样和半环进样。所以，可以进20微升，也可以进10微升，甚至更少。
16、安捷伦液相1290的进样量最大是多少？
答：安捷伦1290在不增加定量环的情况下，通常是20微升。
17、老师，请问流动性ph用醋酸调2.85这个要怎么操作？
答：可以利用pH计进行调节，在调节过程中，流动相中最好不要有甲醇、乙腈等有机相，否则会对pH调节造成影响。
18、反接冲洗之后是不是只能反着用了？
答：不是的，反接冲洗的目的只是疏通堵塞的柱头，洗出污染之后，只要压力正常，也可以正着使用。
19、含量测定要求进5微升，实际进20微升，会影响含量测定结果吗？
答：含量测定是与标样进行对比的，如果标样也是进了20微升，对测定结果是没什么影响的。
20、正相色谱柱的保存方法？
答：正相色谱柱与反向色谱柱一样，都会保存在有机相里。
当初没有报名，错过了这次直播课程！
上述的内容还没有消化！
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（作者：张建 南京海关动植物与食品检测中心 编辑：小析姐）
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【课堂笔记】你要的笔记来啦！高效液相色谱使用必备宝典,高效液相色谱与经典液相色谱
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