氨基酸如何换算KDa(蛋白翻译后修饰——磷酸化（二）)

崭新的一年已经启航，你准备好了吗？偷偷告诉你，伯小远已经做好了充足的准备，在新的一年里小远将继续为大家持续输出科研干货，为大家的科研之路保驾护航，愿大家的实验越做越顺！哈哈，希望大家可以将这份美好传递下去哦！

新的一年我们从磷酸化开始，大家还记得年前伯小远在“蛋白翻译后修饰——磷酸化（一）”中都讲了些什么吗？不记得也没关系，毕竟过年玩的太嗨，谁还记得学习这件事呢，忘记了自己再去温习一下就好啦！这里就不再为大家重复讲解关于磷酸化的基础知识了，今天伯小远将在磷酸化（一）的基础上为大家讲讲文献中都是如何研究磷酸化的，可能介绍不完，毕竟关于磷酸化的研究数不胜数，先挑一些比较有代表性的为大家介绍介绍，后期再继续为大家完善。

磷酸化位点预测

当我们研究一个未知蛋白时，不清楚它是否会发生磷酸化，这个时候可以根据已有的一些实验结果进行猜测，比如蛋白电泳跑出来的条带很模糊，其实际大小略高于预测大小，那么我们就可以猜测研究的蛋白是否发生了磷酸化，然后再进行验证。一般情况下，如果你猜测蛋白可能发生磷酸化，那么它需要包含磷酸化的典型序列，在进行实验之前可以先利用网站进行蛋白磷酸化预测，根据预测结果开展相关实验验证目的蛋白是否真的发生了磷酸化。

小远在这里提供了一些蛋白磷酸化的预测网站：

1、http://macvector.com/

2、http://gps.biocuckoo.cn/

3、https://www.phosphosite.org/staticUsingPhosphosite.action#

4、NetPhos – 3.1 – Services – DTU Health Tech

当使用这些分析网站时，切记它们只是一个预测工具，事实还需要靠实验来证明！

磷酸化影响亚细胞定位

磷酸化修饰调控了广泛的细胞活性，包括细胞周期，分化，代谢等；对于一个具体的蛋白，磷酸化往往会影响它的功能，功能的改变一般都是从亚细胞定位发生改变开始的，下面我们一起来看一个磷酸化改变蛋白亚细胞定位的例子。

在“Phosphorylation regulates the subcellular localization of Cucumber Mosaic Virus 2b protein”一文中，作者为了了解磷酸化对黄瓜花叶病毒2b蛋白的影响，创制了8个不同的突变体来模拟该蛋白的非磷酸化状态（丝氨酸→丙氨酸）以及磷酸化状态（丝氨酸→天冬氨酸）。利用双分子荧光互补实验（BiFC），将野生型2b蛋白本身的相互作用作为阳性对照，将突变体与野生型（Rs-CMV）在细胞定位方面进行了比较。结果显示，Rs2b-N-YFPC和Rs2b-C-YFPC（Rs2b表示野生型2b蛋白）共表达的细胞质和细胞核中均有强烈的YFP荧光，这表明Rs-CMV在细胞质和细胞核中都有定位（图1A）。通过共聚焦显微镜成像，在表达2b/40-42/AAA（2b磷酸化突变体蛋白）的根癌农杆菌细胞共浸润的叶片细胞内未观察到荧光。有趣的是，在2b/40-42/DPD突变体（同样为磷酸化突变体）中，荧光仅在细胞质中检测到，而在细胞核或核仁中未检测到荧光（图2A，B）。这说明磷酸化的2b蛋白在细胞质中积累，磷酸化的2b蛋白阻止了其在细胞核中的积累。

图1 BiFC检测本氏烟草中Rs-2b及其突变体的亚细胞定位。将瞬时表达的2b蛋白融合到黄色荧光蛋白（YFP）的N端或C端。Rs-CMV在细胞质和细胞核中均可明显检测到（A，B）。通过共聚焦显微镜成像，在表达2b/40-42/AAA的根癌农杆菌细胞共浸润的叶片细胞内未观察到荧光。在2b/40-42/DPD突变体中，荧光仅在细胞质中可检测到，而在细胞核和核仁中均未检测到（A，B）。

体外磷酸激酶实验

蛋白激酶通常是多个信号转导网络的常见组分，它们影响了众多负责生物反应的下游效应物，因此，评估某个特定激酶的活性可能为平行通路提供宝贵的信息。生物学样品中的激酶活性分析通常是体外测定的，在ATP存在时将免疫沉淀的激酶与外源底物共同孵育。之后通过一些报告系统来评估特定激酶对底物的磷酸化，包括显色、放射性或荧光检测。蛋白激酶活性分析分为两步：1、末端标记的三磷酸核苷酸供体（通常是ATP，有时用GTP）中的磷酸基团转移到蛋白质或肽底物上；2、将磷酸化的底物分离出并进行定量分析。下面给出了蛋白激酶研究的文献实例。在“Phosphorylation of the transcriptional repressor MYB15 by mitogen-activated protein kinase 6 is required for freezing tolerance in Arabidopsis”一文中，作者为了验证MYB15（一个MYB家族转录因子）能够被重组蛋白MPK6（一种蛋白激酶）磷酸化，首先证明了MYB15可以与MPK6发生直接相互作用，用到的方法分别是酵母双杂、pull down、荧光素酶互补实验。

注：要证明两个蛋白直接互作，一定要用pull down的方法哦！大家一定要记住这个小知识哦，在很多文献中都会出现，大家一定要记得总结！

在证实MYB15与MPK6直接相互作用后，作者使用大肠杆菌表达的纯化蛋白和[γ-32p] ATP进行体外激酶试验，检测了MPK6磷酸化MYB15的能力。SDS-PAGE分离后，用放射自显影法检测凝胶上磷酸化的蛋白，用考马斯亮蓝（CBB）染色观察总蛋白。阴性对照底物GST（~25 kDa）没有磷酸化条带，而MBP（~18.5 kDa；阳性对照）和GST-MYB15（~72 kDa）被MPK6磷酸化。由于MPK通常磷酸化S/T-P基序上的Ser和Thr残基，因此可以预测MYB15中的两个MPK磷酸化位点，即Thr18和Ser168位点。为了验证这一预测，作者使用纯化的GST标记的MYB15 N-末端片段（GST-GST-MYB15N；氨基酸1-172，~45 kDa氨基酸）和GST标记的MYB15 C-末端片段（GST-MYB15C；氨基酸173-285，~45 kDa）作为GST-MPK6（~72 kDa）的底物。在所有样本中均检测到GST-MPK6自磷酸化条带（图2B）。当使用GST-MYB15N作为底物时观察到一条磷酸化条带，而GST-MYB15C则没有，这表明MYB15在预测位点被MPK6磷酸化。

图2 重组MPK6对MYB15的体外磷酸化作用。考马斯亮蓝（CBB）染色和SDS-聚丙烯酰胺凝胶的自显影，其中包含纯化的大肠杆菌表达蛋白和[γ-32P]ATP的指示组合。缩写：MBP，髓磷脂碱性蛋白；GST-MYB15，GST标记全长MYB15；GST-MYB15N，GST标记MYB15 N-端片段（氨基酸1~172）和GST-MYB15C，GST标记MYB15 C-端片段（氨基酸173~285）。MBP和GST分别作为阳性对照底物和阴性对照底物。

质谱法鉴定磷酸化位点

质谱技术已成为蛋白质组学研究的核心技术之一，也是开展蛋白鉴定与分析的主要手段。但是质谱法鉴定磷酸化位点也会存在一些缺陷。首先，磷酸化肽段的信号通常较弱，因为它们带负电荷，而电喷雾质谱在正电模式下作用，因此电离效果不好。其次，在大量非磷酸化蛋白的高背景之下，很难观察到低丰度目的蛋白的信号。为了克服这些缺点，需要对磷酸肽先进行富集。下面还是结合上面例子中的文献，为大家讲一讲如何利用质谱法鉴定磷酸化位点，这里作者主要鉴定了MYB15的磷酸化位点。

作者通过TiO2色谱选择性富集磷酸肽后，通过质谱分析研究了MYB15中的MPK6磷酸化位点（图3）。在纯化的His-MPK6存在和不存在的情况下，分别与纯化的GST-MYB15N进行激酶反应。SDS-PAGE后，作者将GST-MYB15N对应的条带切除，胰酶消化，得到的肽段经MALDI-TOF MS处理。在TiO2色谱前的磷酸化样品的质谱鉴定出该蛋白为GST和MYB15，覆盖率分别为56%和34%（图3B）。经TiO2层析，鉴定出1个磷酸肽，如图3D所示。MPKs通常磷酸化在Ser或Thr残基上的底物，然后是脯氨酸（Pro，P）（S/T-P基序）。被鉴定的磷酸肽包含一个推测的MPK6磷酸化位点Ser168 （SESELADSSNPSGESLFSTS 168PSTS）。因此，MYB15的Ser168位点被确定为MPK6磷酸化位点。

图3 利用TiO2色谱和MALDI-TOF质谱鉴定GST-MYB15N中MPK6磷酸化肽段。（A和B）显示的是未磷酸化的（A）或MPK6磷酸化的（B）GST-MYB15N端片段（氨基酸1~172）经胰蛋白酶消化和未经TiO2纯化的肽质量指纹图谱。通过海量数据的数据库搜索，在样本中识别出GST和MYB15N，覆盖率分别为62%和38%。（C和D）显示的是胰蛋白酶消化未磷酸化（C）或MPK6磷酸化（D）GST-MYB15N经TiO2富集后恢复的磷酸肽的质量指纹图谱。在磷酸化的GST-MYB15N（D）中检测到一个起源于SESELADSSNPSGESLFSTSPSTS的磷酸肽峰（m/z2482.9），而在未磷酸化的GST-MYB15N（C）中未检测到。

为了确定MYB15的磷酸化位点，作者用MYB15的点突变体作为底物进行了体外激酶测定。将纯化的GST-MYB15、GST-MYB15T18A、GST-MYB15S168A和GST-MYB15T18A/S168A（GST-MTB15AA）作为His-MPK6的底物。如图4所示，放射标记的His-MPK6条带的强度在所有样本中大致相同，表明自磷酸化，证实了所有样本中存在足够的酶活性。在含有His-MPK6和GST-MYB15或GST-MYB15T18A的样品中检测到GST-MYB15预期大小的放射标记蛋白（~72 kDa），表明其磷酸化。然而，与MYB15或MYB15T18A蛋白相比，His-MPK6对GST-MYB15S168A和GST-MTB15AA的磷酸化几乎消失，即使检测到微弱的条带。由于质谱分析没有发现除Ser168以外的任何特异性磷酸化位点，这些模糊的条带可能表明突变蛋白MYB15S168A和MTB15AA被MPK6非特异性磷酸化，因为在检测中蛋白水平较高（图3）。因此，Ser168残基对于MPK6诱导的MYB15磷酸化是必要和充分的。

图4 通过定点突变鉴定MYB15上MPK6磷酸化位点。考马斯亮蓝（CBB）染色和SDS-聚丙烯酰胺凝胶的自显影，其中包含纯化的大肠杆菌表达蛋白和[γ-32P]ATP的指示组合。通过定点突变获得MYB15全长蛋白的突变体MYB15T18A、MYB15S168A和MYB15T18A/S168A （MYB15AA）。髓磷脂碱性蛋白（MBP）和GST分别作为阳性对照和阴性对照。

加强版蛋白激酶实验

上面一篇文献中关于蛋白激酶的研究是已知蛋白激酶与底物，然后通过蛋白互作验证方法证明它们之间的直接相互作用之后，接着就进行了体外蛋白激酶实验，证明激酶（MPK6）确实可以磷酸化底物（MYB15）。下面给出一个未知蛋白底物激酶的情况下，要如何进行研究，下面跟着伯小远一起来看看2021年发表在Nature上的一篇文章吧！

在“Light-induced mobile factors from shoots regulate rhizobium-triggered soybean root nodulation”一文中，作者为了鉴定接种根瘤菌后能够磷酸化GmSTF3（大豆TGACG-motif结合因子3）的激酶，作者用免疫沉淀法从接种了GmSTF3-FLAG转基因大豆的根中提取GmSTF3-FLAG，进行液相色谱串联质谱分析。结果鉴定出了一个与GmCCaMK相对应的肽段，这是一种核钙/钙调素依赖性蛋白激酶，在根瘤菌激活的共生信号通路中起作用，并决定根瘤菌侵染和豆科植物根瘤器官发生(Lévy et al., 2004；Gleason et al., 2006；Tirichine et al., 2006)。接着作者通过体外和体内实验证明了GmCCaMK和GmSTF3之间的蛋白相互作用（图5A，B）。通过体外激酶检测，作者证明了GmSTF3可以被GmCCaMK和GmCCaMKT274D（这是一种突变形式，相当于在苜蓿和百脉根中的自激活形式MtCCaMKT271D和LjCCaMKT265D(Gleason et al., 2006；Tirichine et al., 2006)）。磷酸化（图5C，D），在未接种根瘤菌的情况下，GmCCaMKT274D-OX大豆中检测到了GmSTF3的磷酸化条带，但在GmCCaMK-OX中检测不到（图5B），表明根瘤菌激活的GmCCaMK在体内磷酸化了GmSTF3。体外磷酸化和pull-down分析显示，GmFT2a直接与GmCCaMK磷酸化的GmSTF3相互作用（图5E）。

图5 GmCCaMK磷酸化GmSTF3。（A）体外GST-pull down研究GmSTF3与GmCCaMK的相互作用。MBP：髓磷脂碱性蛋白。（B）通过Co-IP检测GmSTF3和GmSTF3与GmCCaMK的相互作用。在不接种USDA110（根瘤菌）的情况下，分别从GmCCaMKWT-FLAG和GmCCaMKT274D-FLAG稳定转基因大豆根部提取总蛋白。空载体转化的Ws82作为阴性对照。箭头表示GmSTF3条带。D，Asp。T，Thr。（C）GmCCaMK在体外使GmSTF3磷酸化。上面的方框显示了放射自显影。底部方框显示考马斯亮蓝（CBB）染色。星号表示一个非特异性的条带。（D）GmCCaMKT274D在体外磷酸化GmSTF3变体。（E）GmFT2a在体外与GmCCaMKT274D磷酸化的GmSTF3相互作用。

小远叨叨

这篇文献中作者首先是通过液相色谱串联质谱的方法找到了能够磷酸化GmSTF3的激酶，比起上一篇文献，这个步骤是额外的，实验难度比起上一篇文献有所增加。找到能够磷酸化GmSTF3的激酶GmCCaMK之后，作者也是通过蛋白互作的验证方法证明了它们之间的直接相互作用，最后作者不仅通过体外蛋白激酶实验验证了GmCCaMK可以磷酸化GmSTF3，还通过体内实验（检测两种过表达材料内是否存在GmSTF3磷酸化条带）验证了GmCCaMK确实可以磷酸化GmSTF3，可以看到增加了体内实验，其段位一下子就上去了，大家可以多学习学习这类优秀文章的实验方法哦！

磷酸化对信号通路的调节作用

接下来我们仍接着上面例子中的文献往下讲，为了探究GmCCaMK介导的GmSTF3磷酸化如何控制GmFT2a-GmSTF3模块的转录活性（其中GmFT2a是开花关键基因），作者首先通过质谱仪鉴定了GmSTF3上几个可能的GMCCaMK磷酸化位点，然后创建了一系列突变蛋白：GmSTF3S27AS28AS29AS30AS31A、GmSTF3T87AT93A、GmSTF3S156AT157A。体外磷酸化实验表明，GmSTF3碱基区亮氨酸zipper（BRLZ）域的Ser156和Thr157残基是GmCCaMK磷酸化的关键位点（图5D）。使用GmSTF3突变体的双荧光素酶实验分析显示，共表达GmFT2a-GmSTF3S156AT157A和GmCCaMKT274D的大豆叶片中NIN、NF-YA1和NF-YB1的表达低于共表达GmFT2a-GmSTF3和GmCCaMKT274D的叶片，并且GmSTF3S27AS28AS29AS30AS31A和GmSTF3T87AT93A没有改变GmSTF3的激活潜能（图6E），这与双荧光素酶报告系统中磷酸化的GmSTF3水平一致。此外，作者还发现GmSTF3S156AT157A-OX毛根比GmSTF3-OX毛根产生的根瘤更少（图6F）， GmSTF3S156AT157A的磷酸化也减少（图6G）。因此，根瘤菌激活的GmCCaMK使GmSTF3的Ser156和Thr157残基磷酸化，并触发GmFT2a-GmSTF3模块的形成和转录活性，该模块调节根瘤器官发生所需基因的表达。

图6 GmCCaMK-GmSTF-GmFT模块诱导大豆结瘤。（E）本氏烟的瞬时基因表达分析。LUC报告基因与不同的效应因子共转染。（F）表达GmSTF3S156AT157A的毛状根的根瘤数。（G）（F）中根瘤在0和6dpi时的相对蛋白水平。在（E）至（G）中的缩写说明，m1：S27AS28AS29AS30AS31A、m2：T87AT93A、m3：S156AT157A、S：Ser、A：Ala。

小远叨叨

磷酸化的研究如此精彩，可是公众号文章篇幅有限，今天就只能为大家介绍这么多了。本次的文章主要为大家讲解了蛋白激酶的作用机制，结合文献进行了具体的分析，以及简单介绍了预测磷酸化的一些网站和磷酸化改变蛋白亚细胞定位的例子，希望对大家的学习有所帮助哦，后面还有好的文章再给大家继续总结哟！

References：

Gleason C, Chaudhuri S, Yang T, et al. Nodulation independent of rhizobia induced by a calcium-activated kinase lacking autoinhibition[J]. Nature, 2006, 441(7097): 1149-1152.

Kim S H, Kim H S, Bahk S, et al. Phosphorylation of the transcriptional repressor MYB15 by mitogen-activated protein kinase 6 is required for freezing tolerance in Arabidopsis[J]. Nucleic Acids Research, 2017, 45(11): 6613-6627.

Lévy J, Bres C, Geurts R, et al. A putative Ca2+ and calmodulin-dependent protein kinase required for bacterial and fungal symbioses[J]. Science, 2004, 303(5662): 1361-1364.

Nemes K, Gellért á, Almási A, et al. Phosphorylation regulates the subcellular localization of Cucumber Mosaic Virus 2b protein[J]. Scientific reports, 2017, 7(1): 1-12.

Tirichine L, Imaizumi-Anraku H, Yoshida S, et al. Deregulation of a Ca2+/calmodulin-dependent kinase leads to spontaneous nodule development[J]. Nature, 2006, 441(7097): 1153-1156.

Wang T, Guo J, Peng Y, et al. Light-induced mobile factors from shoots regulate rhizobium-triggered soybean root nodulation[J]. Science, 2021, 374(6563): 65-71.