氨基酸双向层析法(蛋白纯化策略–纯化方案的确定)

蛋白质的分离纯化说白了就是从众多杂蛋白中以最温和的条件、最少的步骤、最高的收率、最高的纯度回收我们的目的蛋白。为了达到如上目的，兼顾收率及纯度我们需要综合分析待纯化蛋白的基本性质：如等电点、疏水性、是否具备链内链间二硫键、是否有蛋白标签以及标签是否暴露等等。知道了上述目的蛋白参数后即可从众多的纯化方法中选择我们所需要的一种和几种来分离目的蛋白；

1）蛋白质的分离纯化方法

沉淀法（特别常用盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法）、膜分离法（超滤法、透析法）、色谱法、离心分离法等。每类方法有其自己的特点和适用范围。如粗提常用沉淀法，精提就不会用沉淀法。这些方法中，应用最广的是色谱法。

色谱法，在生化和医药行业叫层析。但中国化学会、中科院相关部门及有关期刊都规定要叫色谱。在国家有关色谱名词术语的国家标准中 “ chromatography ” 一词翻译成 “ 色谱 ” 。故在此我们将柱分离叫色谱。柱内的分离介质一般也叫填料、固定相。

在蛋白质色谱纯化中最重要的是分离介质和色谱条件的选择。有些从事分离工作的人，拿到样品后常不知道怎么办。其实这两者的选择只要根据分离对象和每种色谱的分离机理来考虑，就可以自行设计分离方案。蛋白质分离介质的选择应从蛋白质分子结构入手考虑。

2）基于蛋白质分子的结构的凝胶过滤尺寸排阻SEC的方法

蛋白质分子量大，都在 6kD 以上，是由多个氨基酸按一定序列通过肽键组合成肽链，再由一个或多个肽链通过共价键和非共价键组合成有复杂三级、四级结构的蛋白质分子。蛋白质还可能与糖、脂及核酸结合得到结合蛋白，不同的结合蛋白在性质上会有差异。蛋白质的外形为球状和纤维状，其大小因其分子量不同差异很大。故可以用排阻色谱、超滤和膜法分离大小不同的蛋白质。

使用的色谱介质时要注意其合适的分子量适用范围。

一般的介质都是多孔的，多孔介质的比表面有 90%~95% 是在孔内。分离时充分利用孔内表面，柱容量才能大。所以要根据样品分子量选择具有合适的孔的介质。在排阻色谱中孔的大小用排阻极限表示；其他色谱用分子量适用范围表示，实际是其基质的排阻极限。

常用的蛋白质分离介质是琼脂糖和葡聚糖系列。琼脂糖的分子量适用范围取决于制备时琼脂糖的浓度，大家熟悉的 4B ，糖的浓度是 4% ，适用 60kDa ~20000kD 分子量； 6B 糖的浓度是 6% ，适用 10kDa ~1000kDa 分子量。葡聚糖系列的分离范围要看产品说明书，从几千到上千万不等（需注意的是，由于某些葡聚糖基质的填料刚性较差，人工装填分子筛时尤其要注意设置恒压装柱以及装柱操作细致，否则该基质的分子筛很难达到理想的塔板数）。

常用的硅胶系列孔径有用于小分子的 6~12nm ；有用于一定分子量蛋白质的 30 、 50 、100nm 。

3）基于蛋白质带电性的离子交换层析的方法

蛋白质与氨基酸一样，会两性离解，在不同的 pH 下形成正离子或负离子，蛋白质也有等电点。在相同的 pH 下，不同的蛋白质表面带电情况不一样，故可以用离子交换色谱分离蛋白质。

首先需要选择阴离子或阳离子介质，如果目的蛋白的等电点已知，选择阴离子介质且操作的pH高于目的蛋白的pI，或选择阳离子介质且操作pH低于目的蛋白的pI。如果靶蛋白的pI未知，开始之前最好先测定它。最佳操作pH可根据经验确定。因为大多数蛋白质的pI低于7，选择阴离子交换和操作pH为8.5开始是合理的，然后根据估计结果和优化条件。知道蛋白质溶液中污染物pI和结合特征也是有用的。

常见的离子交换问题及解决方案

4）基于蛋白质的氨基酸残基的疏水性的解决方法

蛋白质的氨基酸残基会有一些苯基、烷基等疏水性基团，这些疏水侧链在水相中会尽可能避开水相而藏于蛋白质分子内部，形成蛋白质分子外部亲水性基团多，疏水性基团多在蛋白质裂隙内部的情况，在不同条件下蛋白质裂隙会有不同的伸展而暴露出内部的疏水基团。在同一个介质中，不同蛋白质表面的疏水性不同，可以用疏水相互作用色谱和反相色谱分离。

一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。

但是需要注意，疏水层析一般都需要较高的盐离子浓度以使目的蛋白与层析填料结合，使用该方法需确定目的蛋白能够耐受至少0.5M以上的硫酸铵或者其他盐浓度；

5）其他亲和层析

生物大分子有一个特性，某些分子或基团对它们有特异性很强的吸附作用。这种作用只针对一种或一类目标物质。如镍NI与6*His标签的结合作用、谷胱甘肽过氧化物酶与还原性谷胱甘肽、抗体特异性吸附抗原，苯甲脒对含丝氨酸的蛋白质有吸附作用。这就是亲和色谱的应用原理 , 一般的小分子是不会有这种特异性吸附作用的。

6）纯化中要特别注意保持样品的生物活性

蛋白质有复杂的三级、四级结构，热、光和化学品会导致其理化性质改变和生理活性丧失，这叫失活。失活有可逆和不可逆两种。不可逆失活的蛋白质常是固体，不溶于水和溶剂，不再具有蛋白质原有的生理性质。可逆失活的蛋白质可用不同的复性方法恢复其原有的生理活性。

蛋白质在选择和评价分离纯化的方法、介质和色谱条件时，不仅要注意样品的质量回收率，还特别要重视活性回收率。要保持样品的生物活性，在分离方法、填料、色谱条件和操作工艺上要注意。

在排阻、离子交换、疏水和反相、亲和四类色谱中，反相色谱一般容易使样品失活，常用于定性、定量分析和氨基酸序列分析，不太用于制备；其他的色谱方法，只要条件选择合适，都可以得到高的活性回收率。

蛋白质的三维结构