氨基酸kd(看图说诺奖（3）——2021年诺贝尔生理学或医学奖图解)

本期是《看图说诺奖》（3）

（24） 在上一期（《看图说诺奖（2）》），我们介绍了诺奖得主大卫·朱利叶斯（David Julius）教授的研究揭开了感知温度的机制，但机械压力如何转化为人体触觉仍是未解之谜。

日常生活中，被爱人爱抚，被仇人扇了一巴掌，被自家宠物咬了一口，这些感知觉都离不开对“力”的感受。科学家们一直试图找到感受“力”的离子通道，去理解我们感知觉这重要的一部分。

2010年，美国加利福尼亚州拉霍亚的斯克里普斯研究所的阿登·帕塔普蒂安（Ardem Patapoutian）团队在《科学》杂志报道了哺乳动物中首类介导阳离子内流的机械门控离子通道——Piezo蛋白家族，平地惊雷般的开启了一个领域。因与触觉等关键的基础机械感觉关系密切，该蛋白自发现伊始便作为明星分子活跃在各大学术期刊上。帕塔普蒂安更是因这一发现被授予2021年诺贝尔生理学或医学奖！

（25） 故事开始于十多年前。彼时，帕塔普蒂安和他的博士后研究生伯特兰·科斯特（Bertrand Coste）制定了一个研究计划。他们从一种小鼠细胞入手，这种细胞能够将用移液管轻轻戳一下的微小力量，转换成可测量的电流。他假设被机械力激活的受体是离子通道，并且在下一步中鉴定了编码可能受体的72个候选基因。72个基因被一一灭活，以发现负责研究细胞机械敏感性的基因。换句话说，科斯特敲除候选离子通道基因中的一个（每批细胞中敲除一个不同的基因），通过观察哪批细胞突然失去了其触觉敏感性，确定相关基因。

起初，科斯特非常自信，认为只要花上几个月甚至几周的时间就能成功。

然而实验几乎花了一年的时间。2009年年底，帕塔普蒂安和他的同事们成功地确定了一个基因，该基因沉默后，细胞对微量移液器的戳刺不再敏感。一种全新的、完全未知的机械敏感离子通道已被发现，并以希腊语中表示压力的词(í;píesi)命名为Piezo1。

根据与Piezo1的相似性，帕塔普蒂安和他的同事还发现了第二种与压力感知相关的离子通道，并将其命名为Piezo2。

研究还发现，通过对细胞膜施加压力，Piezo1和Piezo2离子通道可以被直接激活。帕塔普蒂安以及其他团队在此基础上发表了一系列论文，证明了Piezo2离子通道对触觉至关重要，此外还在身体位置和运动感知方面发挥着关键作用。

（26） 帕塔普蒂安的突破使得他和其他团队发表了一系列论文，证明Piezo2离子通道对触觉至关重要。此外，Piezo2被证明在重要的身体位置和运动感知（称为本体感觉）中发挥关键作用。在进一步的工作中，Piezo1和Piezo2通道已被证明可以调节其他重要的生理过程，包括血压、呼吸和膀胱控制。在包括鱼类、鸟类、啮齿类动物和人类在内的脊椎动物中，Piezo2介导了轻触觉。

相比之下，Piezo1在多种生理过程，包括感知血流剪切应力以正确形成血管，调控红细胞功能，及控制细胞迁移和分化中发挥广泛的作用。

在人类，Piezo1或Piezo2突变与几种遗传病，包括脱水遗传性口形红细胞增多症、5型关节挛缩症、Gordon综合征及Marden–Walker综合征有关。这些研究发现表明了Piezo通道的功能重要性、病理相关性及作为治疗靶点的潜力。

（27） 2015年,研究人员通过结合蛋白质工程、X-射线晶体学、单颗粒冷冻电子显微镜及活细胞免疫染色，获得了分辨率为4.8埃（?）的全长（2,547个氨基酸）小鼠Piezo1(Piezo1)的结构。由此提供了有关这类新型机械敏感性离子通道离子传导及门控机制的一些重要见解。

（28） 2018年1月，研究人员在《自然》（Nature）杂志上发文，通过解析哺乳动物机械门控Piezo1离子通道的高分辨率三维结构，揭示了这种通道参与机械力感受与传递的关键功能位点，进而首次提出了Piezo通道以类似杠杆原理进行机械门控的精巧工作机制。该研究对理解生物机体如何将机械力刺激转化为电化学信号这一基本生命过程具有重要意义。2018年4月，研究人员又针对Piezo通道缺乏药理学工具分子这一问题，其研究组首先利用高通量药物筛选的方法鉴定发现了Piezo1通道的两个小分子化合物激动剂，取名为Jedi。利用Jedi做为工具分子并结合电生理膜片钳技术、Piezo通道的突变体的构建和功能检测、以及表面等离子共振技术进行蛋白和药物结合检测，他们发现Jedi结合在Piezo1通道外周桨叶（Blade）的胞外部分。非常有意思的是Jedi与Piezo1结合后会利用Piezo1关键机械传感元件，包括胞外loop区域L15-16和L19-20以及胞内的长杆结构（Beam）上的L1342和L1345两个氨基酸位点，来远距离激活位于中心的负责离子通透的孔道区。

上图为：Piezo1通道利用杠杆原理进行化合物（Jedi）或机械门控的作用机制示意图。

（A，B）由9个重复性的、以4次跨膜区为基础的跨膜螺旋单元(THU)所组成的38次跨膜区的拓扑结构示意图（A）及结构组成展示图（B）。（C）Piezo1通道的三聚体三叶螺旋桨状结构。参与机械力及Piezo1激动剂（Jedi）感受与传递的关键功能位点1-3组成分子内杠杆传递装置，从而将外周THU所感知的细微机械力或小分子化合物Jedi结合（F1，蓝色虚线箭头）有效传递并放大到用于控制中心孔道区开放的作用力（F2，红色虚线箭头），从而有效控制其通道的开放和选择性阳离子通透（图B，C）。基于其研究结果，他们提出了Piezo通道利用杠杠原理进行远程化合物与机械门控的作用机制假说（图A，B），他们认为Piezo1通道利用由9个THU组成的Blade作为机械力感受器,而其Beam结构以L1342/L1345所在位点作为支点形成分子内杠杆传递装置，从而将外周THU所感知的细微机械力或小分子化合物结合（F1，蓝色虚线箭头）有效传递并放大到用于控制中心孔道区开放的作用力（F2，红色虚线箭头），从而有效控制其通道的开放和选择性阳离子通透（图B，C）。这一分子内信号传递通路与机制的揭示为后续开发Piezo1通道的小分子药物提供了重要线索。

（29） Piezo1由2500多个氨基酸组成，重达300 KD，它共穿越细胞膜38次，几乎是破纪录的存在。（作为对比参考，哺乳动物体内蛋白质通常包含近500个氨基酸。）

可惜，如此“庞然大物”却妨碍了研究人员解答Piezo领域最热门的问题：这种机械敏感通道如何感应力？它们如何打开和关闭？

幸运的是，2013年肖百龙组建自己的实验室时，一种能够获得高分辨率结构图像的技术出现了：冷冻电镜技术。他的研究团队利用该技术，在2015年第一次报道了Piezo1的结构。此后，他的团队、MacKinnon团队和帕塔普蒂安团队又先后报道了若干高分辨率版本。此后，肖百龙团队进一步得到了Piezo2的结构图，其大小和形状与Piezo1类似。所得的图像非常惊艳。三个Piezo蛋白形成三聚体穿过细胞膜（详见“压力感受器”）。以中央孔为中心，三个蛋白盘旋向外，就像螺旋桨叶片那样。它们向上向外弯曲，在细胞表面形成了一个深深的凹陷结构。

（30） 帕塔普蒂安和肖百龙认为，当有机械力作用于细胞膜时，“叶片”结构会在细胞膜内侧带动“支撑杆”结构，从而使中央孔打开。而MacKinnon认为，Piezo的“叶片”结构让细胞膜起褶的方式，或许暗示了一种不同的机制：无论推或拉，都将增加细胞膜张力，弯曲的通道可能会被拉平，从而打开。

这些假设目前还无法检验，因为研究人员迄今仅能研究被分离出来的Piezo蛋白，这些蛋白已经与细胞膜分离且处于闭合状态。如果能拍摄Piezo在细胞膜中且处于打开状态的图片，应将有助于科研人员了解其秘密。

（31） Piezo是一种阳离子通道蛋白，能够直接感受到膜上的机械力来让离子通过。在2015年的时候，Ge Jingpeng等人用蛋白质工程学、负染色电镜、冷冻电镜和X射线晶体学等技术对Piezo蛋白的结构进行分析。负染色电镜的结果如下图A，在其中的黄圈中，可以清晰地看出，Piezo有三个旋臂。为了提高分辨率，他们又使用冷冻电镜技术对此进行成像，结果如下图B中，Piezo有三个形状规则的旋臂，互成120°角，形成如同风扇叶片一样的螺旋桨结构。从侧面看，Piezo的轴向高度为150?，横向直径为200?，同时用各种蛋白质工程技术，分析出Piezo蛋白有900 Kilodalton，含有2547个氨基酸，是一个巨大的通道蛋白。但是这篇Nature文章由于发表时间尚早，冷冻电镜技术还没有那么成熟，分辨率只能达到4.8?，所得结果只能分析出Piezo蛋白的大致结构，是三个螺旋桨叶片加一个盖帽，并形成一个中心凹陷的圆顶结构，对于组成每一个旋臂的亚基的38个跨膜螺旋中，只分析出了其中14个，并且没有分析出氨基酸侧链。

（32）在下图中，A：Piezo的侧视图，黄线和黑线是磷脂双分子层的对应位置，上方是细胞外侧，下方是细胞质；B：三聚体中一个单体的带状图，灰线是磷脂双分子层的位置；C：中心孔侧视图，黄色框中的为孔径大小；D：上方为单体的卡通图，跨膜螺旋显示为圆柱体，环线显示为实线，未解析的为虚线和灰色，下方左侧图为已解析的六个THU和两个构成中心体的TM的俯视排列图，下方右侧是单个THU中的TM的带状图，和构成中心体的TM37和TM38的带状图；E：每个单体的弯曲角度，从左至右依次为俯视图，侧视图和仰视图。

除此之外，三个旋臂的螺旋桨叶片形状的形成角度也让人很感兴趣。从下图E中能看出，THU3-THU6为一组，THU7-THU9为一组，两组之间形成了一个角度，从俯视图中看出，叶片形成100°角，从侧视图中看出，叶片上翘为140°角。

（33） 伴随着分子水平研究的兴起，Piezo生理功能的研究亦如火如荼。人们发现，Piezo参与的机械感觉相关的生理过程远比想象的要广。从直观的触觉、本体感觉到生命最基础的细胞分裂、增殖，都有Piezo的身影。而且，不仅限于哺乳动物，在鸟类、斑马鱼、果蝇、植物等其他物种中，Piezo均参与了机械力传导的生理过程。可见Piezo在进化上的功能保守性和重要性。