氨基酸展层液怎样配置（如何配置氨基酸溶液）

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1、氨基酸纸层析展层计

2、氨基酸展开剂选择原理

3、用分配层析法分离氨基酸应注意哪些问题,为什么?

氨基酸纸层析展层计
究其原因，经自己多次亲手操作，多次反复对比，始悟出一些道理，叙述如下：拖尾现象是指展层，显色后在层析分配图上，所看到的某一种氨基酸的分子位移，不是如标准图谱所示的那样，完整地显示在某一位置上，而是形成象笤帚似的那样，前端粗圆而逐渐细小下来，宛如拖着一个尾巴。其图所呈颜色也是由浓渐淡。其图象的出现，原认为是在实验中，对影响Rf值的主要因素要求，掌握不够所致。诸如，物质结构与极性对Rf值的影响，层析溶剂对Rf值的影响，PH对Rf值的影响(溶剂、滤纸和样品的PH值)，温度对Rf值的影响，滤纸的质地是否均匀，薄厚是否适当，纤维的松紧度是否适中等对Rf值的影响，展层的方式(上行、下行)对Rf值的影响。然而在多次实验过程中无论怎佯严格遵循其影响Rf值的主要因素的要求，都仍不可避免地要出现拖尾现象。此时，这就需要从具体操作规范方面，诸如样品的处理，点样、展层、显色等几个操作程序去考虑思索，经仔细分析，样品的处理是为除去杂质纯化样品，达到层析分配某氨基酸的情晰显色图像；展层过程是在上述影响Rf值的主要因素要求下

　　进行，使样品达到一个适当的位移，便于在显色后从图象上，区分不同样品的氨基酸；显色是在用配制好的，与水不相混合，并挥发性较快的 邑剂喷雾后迅速吹干的。更何况显色剂又是含水量极低，不会影响洋品的斑点扩散，那么问题就集中在点样这个操作程序上了。点样是将被层析分配的几种氨基酸混合液，和为了对照实验结果，而分别配制的几种氨基酸的溶液，用微量点样管或毛细管，或血球计数器将5一j5微升的样品，点在以滤纸为惰性支持物的层析纸上设计好的多点位置中去。点样后要自然风干，或冷风吹干。最好不要用加热装置，如吹风机，灯泡之类的热源将其样品点加速干燥。因为加热装置在学生操作时，一但注意不够，掌握不好，则温度升高势必要使样品破坏，更会使佯品点干的太燥。正是由于这样，样品点太干燥，使其样品物的分子，牢固地吸牢在层析纸的纤维上。所以在展层过程中，样品点的每个物质分子，不能在层析纸上同时起步，而是形成了有先有后，鱼贯而上行或下行的状况，最终使洋品物质的分子，不能同时都集中到达一个位置。致使在显色后，实验结果的图象上，观察到的不是一个完整的斑点，而是一个拖着尾巴的斑点。这就是上述所说的拖尾现象。

　　卤、结束语 ’

　　纸上分配层析所出现的拖尾现象，究其原因很简单，就是在点样品后，样品点吹的太干燥所致。原因太简单了，往往被人们容易忽略，更引不起人们的重视。但它确实在困扰着人们的实验效果。为此，建议应在该实验的点样操作中，加上一句，“样品点不要砍的太干燥，否则，样品物质的分子，会牢吸在层析纸的纤维上，出现拖尾现象”。

　　氨基酸展开剂选择原理
选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷己烷苯乙醚THF乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有：Petroleumether/Ethylacetate,petroleumether/Acetone,Petroleumether/Ether, Petroleumether/CH2Cl2, ethylacetate/MeOH,CHCl3/ethylacetate

　　展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。展开剂的选择条件：①对的所需成分有良好的溶解性；②可使成分间分开；③待测组分的Rf在0.2~0.8之间，定量测定在0.3～0.5之间；④不与待测组分或吸附剂发生化学反应；⑤沸点适中，黏度较小；⑥展开后组分斑点圆且集中；⑦混合溶剂最好用新鲜配制。

　　一般来说，弱极性溶剂体系的基本两相由正己烷和水组成，再根据需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯来调节溶剂系统的极性，以达到好的分离效果，适合于生物碱、黄酮、萜类等的分离；中等极性的溶剂体系由氯仿和水基本两相组成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于蒽醌、香豆素，以及一些极性较大的木脂素和萜类的分离；强极性溶剂，由正丁醇和水组成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于极性很大的生物碱类化合物的分离。很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。

　　我们在实验中，为了实现一个配体与其他杂质有效分离，曾经尝试了很多种的溶剂组合，最后才找到石油醚—EtOAc—HCOOH（5.5：3.5：0.1）混合溶剂。一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例（或者加入第三种溶剂）,达到最佳效果；如果没有分开的迹象（斑点较“拖”），最好是换溶剂。对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里往往加一点点三乙胺，氨水，吡啶等碱性物质来中和硅胶的酸性。（选择所添加的碱性物质，还必须考虑容易从产品中除去，氨水无疑是较好的选择。）分离效果的好坏和所用硅胶和溶剂的质量很有关系：不同厂家生产的硅胶可能含水量以及颗粒的粗细程度，酸性强弱不同，从而导致产品在某个厂家的硅胶中分离效果很好，但在另一个厂家的就不行。溶剂的含水量和杂质含量对分离效果都有明显的影响。温度，湿度对分离效果影响也很明显，在实验中我们发现有时同一展开条件，上下午的Rf截然不同展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素来考虑在进行薄层层析时，首先应该知道未知化学成分的类型，其极性的大致归属，从提取液或从色谱柱的流动相极性可知，另外某样品里含多种化学成分先按极性不同大致分，然后细分，对于分离未知的化学物质，展开剂的选择也是一个摸索的过程，不应该仅仅从展开剂考虑，多因素综合衡量！

　　溶剂：层析过程中溶剂的选择，对组分分离关系极大。在柱层析时所用的溶剂（单一剂或混合溶剂）习惯上称洗脱剂，用于薄层或纸层析时常称展开剂。洗脱剂的选择，须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑在用极性吸附剂进行层析时，当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成分，则须选用极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂（如以硅藻土或滑石粉代替硅胶），则洗脱剂的极性亦须相应降低。

　　在柱层操作时，被分离样品在加样时可采用于法，亦可选一适宜的溶剂将样品溶解后加入。溶解样品的溶剂应选择极性较小的，以便被分离的成分可以被吸附。然后渐增大溶剂的极性。这种极性的增大是一个十分缓慢的过程，称为“梯度洗脱”，使吸附在层析柱上的各个成分逐个被洗脱。如果极性增大过诀（梯度太大），就不能获得满意的分离。溶剂的洗脱能力，有时可以用溶剂的介电常数（ε）来表示。介电常数高，洗脱能力就大。以上的洗脱顺序仅适用于极性吸附剂，如硅胶、氧化铝。对非极性吸附剂，如活性炭，则正好与上述顺序相反，在水或亲水住溶剂中所形成的吸附作用，较在脂溶性溶剂中为强。

　　3．被分离物质的性质：被分离的物质与吸附剂，洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素，彼此紧密相连。在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况，直接与被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言，成分的极性大，吸附住强。

　　当然，中草药成分的整体分子观是重要的，例如极性基团的数目愈多，被吸附的住能就会更大些，在同系物中碳原子数目少些，被吸附也会强些。总之，只要两个成分在结构上存在差别，就有可能分离，关键在于条件的选择。要根据被分离物质的性质，吸附剂的吸附强度，与溶剂的性质这三者的相互关系来考虑。首先要考虑被分离物质的极性。如被分离物质极性很小为不含氧的萜烯，或虽含氧但非极性基团，则需选用吸附性较强的吸附剂，并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数中药成分的极性较大，则需要选择吸附性能较弱的吸附剂（一般Ⅲ～Ⅳ级）。采用的洗脱剂极性应由小到大按某一梯度递增，或可应用薄层层析以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况。此外，能否获得满意的分离，还与选择的溶剂梯度有很大关系。现以实例说明吸附层析中吸附剂、洗脱剂与样品极性之间的关系。如有多组分的混合物，象植物油脂系由烷烃、烯烃、舀醇酯类、甘油三酸醋和脂肪酸等组份。当以硅胶为吸附剂时，使油脂被吸附后选用一系列混合溶剂进行洗脱，油脂中各单一成分即可按其极性大小的不同依次被洗脱。

　　又如对于C-27甾体皂甙元类成分，能因其分字中羟基数目的多少而获得分离：将混合皂甙元溶于含有5％氯仿的苯中，加于氧化铝的吸附柱上，采用以下的溶剂进行梯度洗脱。如改用吸附性较弱的硅酸镁以替代氧化铝，由于硅酸镁的吸附性较弱，洗脱剂的极牲需相应降低，亦即采用苯或含5％氯仿的苯，即可将一元羟基皂甙元从吸附剂上洗脱下来。这一例子说明，同样的中草药成分在不同的吸附剂中层析时，需用不同的溶剂才能达到相同的分离效果，从而说明吸附剂、溶剂和欲分离成分三者的相互关系。

　　（二）簿层层析：薄层层析是一种简便、快速、微量的层析方法。一般将柱层析用的吸附剂撒布到平面如玻璃片上，形成一薄层进行层析时一即称薄层层析。其原理与柱层析基本相似。

　　1．薄层层析的特点：薄层层析在应用与操作方面的特点与柱层析的比较。

　　2．吸附剂的选择：薄层层析用的吸附剂与其选择原则和柱层析相同。主要区别在于薄层层析要求吸附剂（支持剂）的粒度更细，一般应小于250目，并要求粒度均匀。用于薄层层析的吸附剂或预制薄层一般活度不宜过高，以Ⅱ～Ⅲ级为宜。而展开距离则随薄层的粒度粗细而定，薄层粒度越细，展开距离相应缩短，一般不超过10厘米，否则可引起色谱扩散影响分离效果。

　　3．展开剂的选择：薄层层析，当吸附剂活度为一定值时（如Ⅱ或Ⅲ级），对多组分的样品能否获得满意的分离，决定于展开剂的选择。中草药化学成分在脂溶性成分中，大致可按其极性不同而分为无极性、弱极性、中极性与强极性。

　　用分配层析法分离氨基酸应注意哪些问题,为什么?
氨基酸的分离鉴定——纸层析法

　　一,实验目的

　　掌握氨基酸纸层析的方法和原理,学会分析待

　　测样品的氨基酸成分.

　　二,实验原理

　　纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析.滤纸纤维上的羟基具有亲水性,吸附一层水作为固定相,有机溶剂为流动相.当有机相流经固定相时,物质在两相间不断分配而得到分离.

　　溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示:

　　Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

　　在一定的条件下某种物质的Rf值是常数.Rf值的大小与物质的结构,性质,溶剂系统,层析滤纸的质量和层析温度等因素有关.本实验利用纸层析法分离氨基酸.

　　三,实验器材

　　(1)大烧杯(5000mL):1只/组

　　(2)微量注射器(100 L):1只/ 组.

　　(3)喷雾器:公用.

　　(4)培养皿:1只/组.

　　(5)层析滤纸(长22cm,宽14cm的新华一号滤纸):1张/组.

　　(6)直尺,铅笔:自备.

　　(7)电吹风:1只/组.

　　(8)托盘,针,白线:1套/组.

　　(9)手套:1双/组.

　　(10)塑料薄膜:公用.

　　(11)小烧杯:50mL,1只/组.

　　四,实验试剂

　　(1)扩展剂:将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中,与5体积水混合,充分振荡,静置后分层,弃去下层水层.

　　(2)氨基酸溶液:0.5%的已知氨基酸溶液3种(赖氨酸,苯丙氨酸,缬氨酸),0.5%的待测氨基酸液1种.

　　(3)显色剂:0.1%水合茚三酮正丁醇溶液.

　　实验试剂

　　五,实验操作

　　检查培养皿是否干燥,洁净;若否,将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干.

　　(1)平衡:剪一大块塑料薄膜铺在桌面上,将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上,再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中,用塑料薄膜密封起来,平衡20min.

　　(2)规划:带上手套,取宽约14cm,高约22cm的层析滤纸一张.在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A,在直线上做4个记号,记号之间间隔2cm,这就是原点的位置.另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B,在B线上以A,B两线的交点为原点标明刻度(以厘米为单位),参见左图.

　　(3)点样:用微量注射器分别取10mL左右的氨基酸样品(每取一个样之前都要用蒸馏水洗涤微量注射器,以免交叉污染),点在这四个位置上.挤一滴点一次,同一位置上需点2～3次,2～3mL/次,每点完一点,立刻用电吹风热风吹干后再点,以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm.每人须点4个样,其中3个是已知样,1个是待测样品.

　　(4)层析:用针,线将滤纸缝成筒状,纸的两侧

　　边缘不能接触且要保持平行,参见图3-3.向培养皿中加入扩展剂,使其液面高度达到1cm左右,将点好样的滤纸筒直立于培养皿中(点样的一端在下,扩展剂的液面在A线下约1cm),罩上大烧杯,仍用塑料薄膜密封.当扩展剂上升到A线时开始计时,每隔一定时间测定一下扩展剂上升的高度,填入表3-1中.当上升到15～18cm,取出滤纸,剪断连线,立即用铅笔描出溶剂前沿线,迅速用电吹风热风吹干.

　　(5)显色:用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液,然后立即用热风吹干,即可显出各层析斑点,参见左图.

　　(6)计算各种氨基酸的Rf值,并判断混合样品中都有哪些氨基酸,各人将自己的实验结果贴在实验报告上,见表3-2.

　　(7)以层析时间为横坐标,扩展剂上升高度为纵坐标画图,求出扩展剂上升到18cm时所需要的时间.

　　(8)将微量注射器内外用蒸馏水清洗干净,倒掉用过的展层液和平衡液,将培养皿洗净,整理好桌面上的仪器和试剂

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